《ACS Chemical Neuroscience》：Aβ-42 Side Chain Deamidation at Q15 or N27 Modulates Protein Aggregation and Alters Microglial Cytokines and CD68
编辑推荐：
淀粉样蛋白β（Aβ）单体逐步聚集为寡聚体是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）发病机制中的关键因素。尽管已证明Aβ的突变形式表现出改变的聚集动力学，但脱酰胺化Aβ对小胶质细胞功能的具体影响仍未得到充分研究。研究团队先前发现脱酰胺变体A
淀粉样蛋白β（Aβ）单体逐步聚集为寡聚体是阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）发病机制中的关键因素。尽管已证明Aβ的突变形式表现出改变的聚集动力学，但脱酰胺化Aβ对小胶质细胞功能的具体影响仍未得到充分研究。研究团队先前发现脱酰胺变体Aβ-42-N27D可改变Aβ聚集、降低神经毒性并减弱小胶质细胞反应性，但Aβ-42侧链脱酰胺总体上对此类参数的影响仍不清楚。本研究在先前工作基础上，利用小鼠小胶质细胞系，研究了两种位点特异性Aβ-42突变（Q15E和N27D，其中中性酰胺侧链被带负电荷的羧酸取代）如何影响聚集和小胶质细胞免疫应答。尺寸排阻色谱（size exclusion chromatography, SEC）、硫黄素T（Thioflavin T, ThT）荧光、圆二色（circular dichroism, CD）和动态光散射（dynamic light scattering, DLS）表明，与Aβ-42野生型（wild type, WT）相比，Aβ-42-Q15E和Aβ-42-N27D表现出减少的聚集。对分泌至培养基中的8种小胶质细胞细胞因子进行的多重分析显示，相对于Aβ-42-WT，Aβ-42-Q15E和Aβ-42-N27D降低了炎症细胞因子如白细胞介素-6（IL-6）、干扰素γ诱导蛋白10（IP-10）和巨噬细胞炎症蛋白-1α（MIP-1α）的表达。免疫细胞化学（immunocytochemistry, ICC）显示，与Aβ-42-WT相比，Aβ-42-Q15E和Aβ-42-N27D降低了CD68表达和细胞内Aβ标记。这些发现证明脱酰胺显著改变Aβ-42聚集和小胶质细胞活化，提示Aβ-42的结构修饰可调节AD中的炎症信号。这项工作为未来研究Aβ-42翻译后修饰作为AD潜在治疗靶点奠定了基础。
**Aβ-42侧链脱酰胺调控聚集与小胶质细胞免疫应答的机制研究**
**一、研究背景与科学问题**
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是一种进行性神经退行性疾病，是全球痴呆的首要病因。β-淀粉样蛋白（amyloid beta, Aβ）在细胞外沉积形成斑块是AD病理学的标志性特征。尽管Aβ斑块本身是否直接驱动病理尚存争议，但Aβ寡聚体与慢性神经炎症均被强烈关联至AD发病机制。小胶质细胞作为脑内常驻免疫细胞，在健康条件下负责清除细胞碎片、修剪突触并维持稳态。在AD早期，小胶质细胞被认为提供保护作用，但随着疾病进展其功能失调，清除Aβ聚集体能力下降，并促成与认知衰退相关的慢性神经炎症状态。Aβ的聚集状态会直接影响小胶质细胞活性，因此解析Aβ特定结构修饰对小胶质细胞活化的影响，对阐明AD炎症机制至关重要。Aβ与TREM2、CD36及Toll样受体等小胶质细胞表面受体相互作用，可异常调节磷酸化蛋白信号级联，驱动包括IL-1β、IL-6和TNF-α在内的炎症细胞因子表达。
已有研究检测到Aβ在体内发生Q15和N27位点的脱酰胺化，5xFAD小鼠及人脑样本的蛋白质组学分析确认了携带这些修饰的Aβ肽段存在于疾病相关组织中。此前研究人员曾发现Aβ-42-N27D（天冬酰胺替换为天冬氨酸）相较野生型Aβ-42聚集减少，且可溶性寡聚体产量显著降低，但关于脱酰胺对Aβ-42聚集及小胶质细胞吞噬功能等更广泛反应的影响仍未明确。为此，本研究系统探究位点特异性脱酰胺（Q15E和N27D）如何改变Aβ-42的聚集动力学及小胶质细胞免疫应答。
**二、研究结论与意义**
研究结果表明，Aβ-42-Q15E和Aβ-42-N27D相较于Aβ-42-WT均表现出明显减弱的聚集倾向、降低的炎症细胞因子表达以及下降的CD68表达和细胞内Aβ内化水平。这些发现证明脱酰胺可显著改变Aβ-42的聚集行为并削弱小胶质细胞活化，提示Aβ-42的结构修饰可调节AD中的炎症信号。该工作为未来探索Aβ-42翻译后修饰作为AD潜在治疗靶点奠定了基础。论文发表于《ACS Chemical Neuroscience》。
**三、主要关键技术方法**
研究人员采用多种生物物理与细胞免疫学手段。使用尺寸排阻色谱（SEC）分离新鲜Aβ单体，并监测24小时聚集后的分子量分布；硫黄素T（ThT）荧光动力学评估交叉β-淀粉样含量；远紫外圆二色（CD）追踪二级结构变化；动态光散射（DLS）测定水合粒径；ζ-电位测量考察表面电荷效应。细胞实验使用经J2逆转录病毒永生化C57BL/6原代小胶质细胞获得的永生化小鼠小胶质细胞系（MMCs），以50 nM可溶性Aβ变体处理。细胞因子采用Luminex多重免疫分析定量8种炎症因子，并借助主成分分析（PCA）进行多变量解析。CD68及细胞内Aβ检测采用免疫细胞化学（ICC），通过6E10抗体识别Aβ，并以ImageJ宏自动定量荧光强度。
**四、研究结果**
**1. Aβ-42在Q15和N27位点的脱酰胺改变聚集行为（Deamidation of Aβ-42 at Q15 and N27 Alters Aggregation）**
研究人员首先通过SEC分离新鲜单体，并在37°C孵育24小时后再注入SEC。结果显示，Aβ-42-WT在约9 mL洗脱体积处出现显著寡聚体峰，而Aβ-42-N27D和Aβ-42-Q15E的寡聚体峰高度较WT降低约75%，单体峰（约14–15 mL）仍占主导，表明脱酰胺减少了从单体向寡聚体状态的转变。ThT荧光动力学显示，WT呈现典型S形淀粉样生长曲线，48小时内平台期荧光达2171 ± 64 mAU；而两种脱酰胺变体全程接近基线（Q15E为27 ± 4 mAU，N27D为49 ± 4 mAU），说明纤维形成显著减弱。远紫外CD光谱在0小时时三种变体均呈无规卷曲特征；24小时后WT在218 nm附近出现β-折叠特征负峰，而两种脱酰胺变体仍保持约205 nm处优势峰的无序构象。DLS测得24小时后WT的水合半径（Rh）为29.5 ± 0.2 nm，Q15E为11.3 ± 0.8 nm，N27D为12.4 ± 4.9 nm，脱酰胺变体粒径约为WT的1/2.5，对应体积约减少15倍。ζ-电位测量显示三种变体表面电位绝对值均小于1 mV，且无统计学差异，提示脱酰胺突变导致的聚集减弱并非源于整体的静电排斥机制。综上，SEC、ThT、CD和DLS四种方法一致证明Q15E和N27D较WT形成更少的聚集体。
**2. Aβ-42脱酰胺调节小鼠小胶质细胞系中的细胞因子表达（Deamidation of Aβ-42 Modulates Cytokine Expression in Mouse Microglial Cell Line）**
为评估脱酰胺变体是否引发不同的细胞因子反应，研究人员以50 nM Aβ变体处理MMCs 24小时，收集培养基后用Luminex多重免疫分析定量8种炎症相关细胞因子。主成分分析（PCA）显示，PC1解释了54%的方差，MIP-1β、MIP-1α和IP-10在PC1上具有最高绝对载荷。PC1得分图显示Aβ-42-WT处理组与其他组明显分离，位于最右侧，而两种脱酰胺变体与vehicle组居中偏左。Aβ-42-WT处理组的PC1得分显著高于vehicle、Q15E和N27D组。单独细胞因子比较中，Aβ-42-WT显著上调MIP-1β、MIP-1α、IP-10和IL-6，而Q15E和N27D则与vehicle接近。两种脱酰胺变体的细胞因子谱高度相似，仅IL-6在Q15E处理中有高于N27D的趋势（p = 0.054）。结果表明脱酰胺变体诱导的小胶质细胞炎症反应显著弱于WT。
**3. Aβ-42脱酰胺减弱小鼠小胶质细胞系中的CD68表达（Aβ-42 Deamidation Attenuates CD68 Expression in Mouse Microglial Cell Line）**
CD68是活化小胶质细胞的溶酶体标志物。研究人员用50 nM Aβ变体处理MMCs 2小时后进行ICC染色（CD68红色，DAPI蓝色）。定量结果显示，Aβ-42-WT处理组的CD68荧光强度（以DAPI核数归一化）显著高于Aβ-42-N27D和Aβ-42-Q15E，而后两者与vehicle无显著差异。N27D与Q15E之间无差异，表明脱酰胺降低了Aβ-42诱导小胶质细胞活化的能力。
**4. 脱酰胺调节小鼠小胶质细胞系中的Aβ-42内化（Deamidation Modulates Aβ-42 Internalization in Mouse Microglial Cell Line）**
为探究CD68降低是否与肽段内化改变相关，研究人员采用识别Aβ4–10表位的6E10抗体进行ICC。在2小时处理时间点，Aβ-42-WT处理组细胞内6E10标记明显高于Q15E和N27D。定量结果显示，Aβ-42-Q15E的6E10归一化荧光强度显著低于WT（p < 0.05），Aβ-42-N27D呈类似下降趋势但未达显著。两种脱酰胺变体之间趋势为Q15E低于N27D，但差异无统计学意义。这些数据说明脱酰胺减少了Aβ-42在2小时内的细胞内摄取，与CD68表达下降一致。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，Aβ寡聚体是小胶质细胞活化、炎症和神经退行性变的重要驱动因素。本研究在方法学上通过SEC分离新鲜单体，消除预成核种子效应，获得了比先前更一致的小胶质细胞反应。SEC、ThT、CD、DLS四种独立方法共同证实Q15E和N27D显著抑制聚集。由于两种突变分别位于不同结构区域（Q15位于中心疏水核心，N27位于转角区域），但产生相似效应，研究人员认为这归因于引入负电荷和丢失侧链酰胺氢键供体的共同特征，而非位点特异的构象破坏。ζ-电位实验排除了整体静电排斥机制，提出局部侧链效应（如引入羧基的去溶剂化代价和丢失氢键供体）是聚集减弱的主要原因。
在细胞功能方面，Aβ-42-WT因其更高寡聚体丰度可能更有效地结合TREM2等优先识别寡聚Aβ的受体，从而驱动更强炎症因子表达。脱酰胺变体寡聚体较少，因此炎症反应减弱。IL-6在Q15E和N27D之间的差异趋势提示两者可能与小胶质细胞表面受体结合方式存在细微不同。CD68和6E10标记降低表明脱酰胺变体的内化或溶酶体加工效率改变，这可能降低内化肽段的炎症负担或增强其清除效率。
本研究存在局限性：永生化小胶质细胞单培养不能完全再现原代小胶质细胞表型；50 nM浓度虽具生理相关性，但突触局部浓度可能瞬态更高；CD68主要反映溶酶体活性而非直接测量吞噬作用；两种脱酰胺变体的受体结合动力学有待深入研究。
总体而言，研究人员的数据表明Aβ-42脱酰胺可减少聚集并抑制小胶质细胞活化。鉴于Aβ聚集和免疫活性在AD中的临床重要性，该发现支持将Aβ-42脱酰胺作为降低其毒性的临床相关策略进行深入研究，特别是开发针对翻译后脱酰胺的新药理学方法可能为AD治疗提供可行途径。
