《Bioconjugate Chemistry》：Selective and Efficient Functionalization of P22 Virus-Like Particles Using an Asparaginyl Ligase
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蛋白质笼因其高度有序的结构及体内自组装能力，成为纳米尺度工程的实用支架。此类支架适用于后期偶联，从而拓展其功能。然而，许多偶联技术缺乏位点选择性、需引入非天然氨基酸，或依赖庞大识别基序以促进连接反应。本研究采用具有连接酶活性的天冬酰胺内肽酶（AEP），对肠杆菌
蛋白质笼因其高度有序的结构及体内自组装能力，成为纳米尺度工程的实用支架。此类支架适用于后期偶联，从而拓展其功能。然而，许多偶联技术缺乏位点选择性、需引入非天然氨基酸，或依赖庞大识别基序以促进连接反应。本研究采用具有连接酶活性的天冬酰胺内肽酶（AEP），对肠杆菌噬菌体P22来源的病毒样颗粒（VLP）进行高效功能化。研究人员证实该酶可在温和反应条件下，通过向P22衣壳蛋白C端添加极小延伸序列，将肽段与蛋白质偶联至已组装的P22 VLP上。研究人员将反应效率进一步拓展至一锅法双功能化反应，在单步反应中将两个治疗相关受体靶向结构域偶联至P22 VLP。最后，研究人员证实AEP介导的生物偶联可赋予P22 VLP体外受体结合功能。本工作展示了AEP连接酶作为生物偶联工具，用于对病毒样颗粒等大型分子组装体进行位点选择性功能化的效能。
研究背景方面，蛋白质笼（protein cages）如病毒、铁蛋白、病毒样颗粒（VLP）等，因可自组装且结构稳定，被广泛用作纳米工程支架。传统功能化策略包括遗传融合与后期偶联，前者受限于亚基须保持有序组装，后者可规避该限制但对酶促工具的位点选择性、识别标签大小及反应条件提出更高要求。现有SpyTag/SpyCatcher系统虽特异但遗留12.7 kDa大标签；排序酶A（sortase A）需特定C端LPXTG识别序列且依赖末端可及性；其他酶如酪氨酸酶、转谷氨酰胺酶、Ubc9等各有局限。AEP连接酶源自Oldenlandia affinis的[C247A]OaAEP1优化变体，仅需极小C端NGLH识别序列（NGL加组氨酸），在室温、低酶量、近无痕条件下催化转肽反应，此前多用于AaLS等小蛋白笼，在P22 VLP这类大型组装体上的高效性尚未充分探索。因此，研究人员开展本研究，旨在评估AEP连接酶介导P22 VLP衣壳蛋白（CP）C端后期功能化的可行性、效率及生物学功能。
主要关键技术方法方面，研究人员构建C端带GGSGG连接子及NGLH序列的工程化P22 CP（CP-NGLH），与融合mRUBY3的支架蛋白（SP-mRUBY3）在Escherichia coli中共表达组装VLP；纯化后利用[C247A]OaAEP1在含NiSO4的PBS（pH 7.4）中室温催化转肽，偶联伙伴含N端GVG或GL延伸的合称肽PDIP、sfGFP、ZHER2 affibody及9G8 nanobody；通过尺寸排阻色谱（SEC）、SDS-PAGE、负染透射电镜（TEM）、胰酶消化LC-MS/MS评估组装与偶联；以密度扫描定量偶联率；通过一锅法共偶联双靶向域；利用重组HER2（胞外域StrepII标签）与EGFR（胞外域6×His标签）包被酶标板，基于封装mRUBY3荧光读取VLP结合信号，行Welch's t检验。
研究结果部分，首先于“Modification of P22 VLP C-Terminus”小节，研究人员将NGLH及GGSGG连接子插入P22 CP C端，与SP-mRUBY3共表达后仍正确组装为58 nm二十面体VLP，SEC、SDS-PAGE、TEM及LC-MS/MS均确认结构完整与序列存在，证明AEP识别位点引入不破坏组装。
于“Conjugation of a Synthetic Peptide”小节，研究人员选用膜选择性穿细胞肽PDIP，化学合成N端GVG延伸的GVG-PDIP作为亲核体。AEP用量仅为VLP底物0.06当量、4当量肽、室温2小时即见偶联带，16小时达35% CP功能化；而无GVG延伸的PDIP几乎不偶联，证实P2″位疏水残基提升效率。延长至16小时见VLP聚集，但SDS-PAGE未见共价寡聚体，归因为表面性质改变致非共价聚集，非AEP通病。
于“Application to Protein Conjugation”小节，研究人员以29 kDa GL-sfGFP为模型，AEP条件同前，2小时达32% CP偶联（约134分子/VLP），效率与sortase A相当但酶量减30倍、亲核体减6倍、时间大幅缩短，TEM确认形貌维持。研究人员指出约30%上限源于五聚/六聚界面C端间距约30 ?的立体位阻。
于“Functionalization of P22 VLPs with Receptor-Targeting Domains”小节，研究人员偶联7 kDa GVG-ZHER2与14 kDa GVG-9G8分别靶向HER2与EGFR，3小时单偶联率分别>30%与20%；一锅法双偶联总功能化约40%，ZHER2占七成；体外受体结合实验显示功能化VLP相对未修饰对照在同源受体上荧光信号显著升高（p<0.01或p<0.001），证实AEP偶联保留靶向域活性。
讨论与结论部分，研究人员总结AEP连接酶可对P22 VLP C端NGLH标签在温和条件下实现肽（4 kDa级）至蛋白（28 kDa级）的位点选择性转肽，偶联痕迹仅余极短序列；一锅双功能化可行且VLP形貌稳定；体外结合证明治疗性靶向域功能不受损。该策略相比SpyTag遗留大标签、sortase依赖特定序列与高温，具备酶量极低、识别标签最小（NGLH）、常温快速、近乎无痕优势。研究人员展望可借赖AEP对暴露赖氨酸的异肽键能力或正交AEP变体，拓展至CP内部位点及顺序偶联，并探索在E. coli或植物体内组装时同步功能化。论文发表于《Bioconjugate Chemistry》“Site-Specific Chemistry”特刊，论证了AEP连接酶作为大型蛋白组装体后期功能化通用工具的效力，为基因编辑递送、mRNA疫苗及肿瘤靶向VLP载体设计提供模块化新路线。
