高速原子力显微镜用基于硅烷的甲基与羧基功能化云母基底

《Langmuir》：Silane-Based Methyl- and Carboxyl-Functionalized Mica Substrates for High-Speed Atomic Force Microscopy

　　

高速原子力显微镜（HS-AFM）能够在溶液中以高时空分辨率可视化生物分子动力学，但要求基底能够稳定吸附生物分子而不扰动其结构或动力学。云母因提供原子级平整表面而被广泛用作HS-AFM基底。已有多种云母表面功能化方法被提出，但并不适用于所有生物分子。研究人员通过引入基于通用硅烷化策略的甲基与羧基（COOH）功能化云母表面，拓展了HS-AFM基底工具箱。其中，COOH功能化云母基底通过温和的硫醇–马来酰亚胺偶联反应制备，可在水相条件下实现高效表面修饰。研究人员利用带不同电荷与形状的蛋白质，通过HS-AFM评估了这些基底上的吸附与扩散行为。依据表面性质不同，观察到分子迁移率与结合存在显著差异。这些结果为基底选择提供了实用指南，并拓宽了HS-AFM在多样生物分子体系中的适用性。

研究背景方面，原子力显微镜（AFM）可在液相中对生物分子进行高分辨成像，但传统AFM成像速度有限，难以捕捉动态过程，因此生物分子通常被强固定化于基底上。高速原子力显微镜（HS-AFM）突破了速度限制，能以亚秒时间分辨率直接观察生物分子的结构变化、分子间相互作用与扩散。在HS-AFM观测中，生物分子需在维持结构与生理功能的同时适度吸附于基底；吸附过强会影响分子结构与功能，过弱则导致分子在基底上快速扩散，因数据异步而产生图像畸变。云母因原子级平整、亲水且在溶液中带负电，成为常用HS-AFM基底，但对部分生物分子吸附过弱致图像模糊。现有氨基化（如APTES）、聚赖氨酸、柱芳烃及脂质双层等修饰基底虽对特定分子有效，但非普适，且许多修饰法涉及气相反应或多步工艺，会增加表面粗糙度与膜厚，不满足HS-AFM对纳米级平整度的要求。为此，研究人员提出采用硅烷化策略在云母上引入甲基（CH₃）与羧基（COOH），以扩展基底选项。

主要关键技术方法方面，研究人员使用新鲜解理的白云母圆片（直径1.5 mm）作为基底，通过硅烷化修饰引入NH₂（APTES）、CH₃（正丙基三乙氧基硅烷）、COOH（经硫醇–马来酰亚胺偶联合成的羧基化硅烷）、TESPSA及Amino-SA等表面；以驻泡法（captive bubble method）在10 mM Tris-HCl（pH 7.5）中测静态接触角评价亲水性；用自搭建HS-AFM以轻敲模式在室温液相中成像，悬臂共振约500 kHz，自由振幅1.5–2.5 nm，设点振幅比0.8–0.9；以avidin（pI≈9.7，糖蛋白）、neutravidin（pI≈6.3，去糖基化）、ovalbumin（pI≈5.2，糖蛋白）及分枝杆菌DNA结合蛋白1（MDP1，pI≈11.6，固有无序蛋白）为模型分子，终浓度0.1–1 μg/mL，孵育3分钟后洗脱未结合分子；利用UMEX与ImageJ（MTrackJ）从时序图像追踪单分子坐标，按MSD=4Dt计算扩散系数（D），并以Kruskal–Wallis检验与Dunn事后检验进行统计。

研究结果部分，3.1节“基于硅烷化的基底修饰”中，研究人员将APTES、正丙基三乙氧基硅烷及经¹H NMR验证的硫醇–马来酰亚胺加成产物（3-巯基丙基三乙氧基硅烷与3-马来酰亚胺丙酸按10:1摩尔比反应）分别稀释放置于云母，形成NH₂、CH₃与COOH自组装单层，COOH基团通过Si–O–Si键固定。3.2节“修饰基底的静态接触角测量”中，驻泡法测得云母43.7°、NH₂ 46.8°、CH₃ 47.0°、COOH 49.3°，三种修饰基底间无统计差异，但均显著高于云母，表明修饰稍降亲水性且表面化学改变成功。3.3节“修饰基底的HS-AFM分析”中，云母RMS粗糙度0.08 nm，NH₂呈双高斯分布高位峰0.25 nm，CH₃为0.12 nm，COOH仅0.03 nm，所有修饰面纳米级粗糙但仍满足HS-AFM平整要求。3.4节“HS-AFM扩散分析验证”中，neutravidin在A_sp/A₀=0.70–0.95时D无显著变化，0.60–0.65时因针尖推移而表观D升高，确认本研究采用0.8–0.9区间不干扰扩散。3.5节“球状分子的扩散分析”中，avidin在云母（860 nm²/s）与NH₂（640）上高扩散，在CH₃（89）与COOH（190）上显著降低；neutravidin在NH₂与COOH上吸附增强；ovalbumin在NH₂上最强吸附，在CH₃上亦降低，提示CH₃通过疏水作用留住糖蛋白。3.6节“硅烷化基底的功能均匀性”中，同一NH₂基底六处位点及不同云母来源的NH₂基底间neutravidin扩散无差异，APTES浓度升高则D渐进下降，说明硅烷化方案具足够均匀性与重现性。3.7节“羧基修饰基底的比较”中，对比TESPSA与Amino-SA羧基基底，本研究的COOH基底上avidin的D（190）显著低于TESPSA（1400）与Amino-SA（470），归因为硫醇–马来酰亚胺反应在水相稳定、不需催化剂、重复性好。3.8节“以MDP1为固有无序蛋白模型的扩散分析”中，MDP1在云母上D=900 nm²/s，在NH₂（570）、CH₃（330）、COOH（610）上均下降，但个体D分布广且无组间显著性，说明无序蛋白行为受静电、纳米粗糙与表面异质性共同影响。3.9节“MDP1单分子观察”中，云母上因扩散过快难捕丝状结构，NH₂与CH₃上停留时间延长可辨组蛋白样区（HUR）球状体与固有无序区（IDR）丝态，COOH上亦能获得稳定单分子影像。

讨论与结论部分，研究人员指出，HS-AFM基底选择需兼顾表面电荷、疏水性、纳米平整度与生物分子电荷/糖基化/无序程度；CH₃基底适合疏水/糖蛋白，COOH基底利于正电蛋白（含IDP如MDP1）稳定成像，NH₂基底对负电蛋白优，而裸云母仅适合快速扩散初筛。所开发的硫醇–马来酰亚胺偶联羧基硅烷可在水相、室温、低浓度（10 μM）下3分钟完成修饰，避免气相/多步法带来的粗糙化，扩展了HS-AFM基底工具箱。论文结论为：通过通用硅烷化引入CH₃与COOH官能团，并结合电荷匹配原则，研究人员为不同电荷、形状及固有无序生物分子提供了可预测的HS-AFM基底选择指南，其中COOH云母基底凭借温和偶联与高重现性，特别适用于正电蛋白与IDP的动态单分子观察，该工作拓宽了HS-AFM在膜蛋白、糖蛋白及无序蛋白体系中的适用边界。论文发表于《Langmuir》。