发掘春小麦遗传资源的潜力：揭示抗叶锈病和黄锈病的抗性来源

《Theoretical and Applied Genetics》：Unlocking the potential of spring wheat genetic resources: uncovering resistance sources against leaf rust and yellow rust

　　

关键信息：将高通量表型分析（high-throughput phenotyping）与多种互补的全基因组关联分析（GWAS）模型相结合，可减少方法依赖性偏差，并能够可靠地鉴定用于小麦黄锈病和叶锈病持久抗性的新位点和优良种质。
摘要：小麦黄锈病和叶锈病的病原体分别为条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp. tritici）和小麦叶锈菌（Puccinia triticina），对全球谷物产量和品质构成严重威胁。种植持久抗性小麦品种是促进可持续农业的有效保护措施。然而，由于病原物种群的高度遗传多样性和适应性，许多已知抗性基因已被克服。因此，本研究旨在利用来自德国联邦外迁基因库（German Federal ex situ Genebank）的1984份春小麦种质，通过全基因组关联分析鉴定与黄锈病和叶锈病相关的新位点。将离体叶片测定获得的表型数据与90,283个基于基因分型测序（genotyping-by-sequencing, GBS）的全基因组标记相结合。分别针对黄锈病和叶锈病鉴定到6个显著的峰值标记-性状关联。这些关联位于1D、2B、3B、4A、4B、4D、5A、6B和7D染色体上。在鉴定的位点附近发现了6个候选基因。这些发现可能有助于识别和利用遗传资源，以拓宽抗性的遗传基础并保障黄锈病和叶锈病抗性的持久性。

小麦是全球最重要的口粮作物之一，但叶锈病（leaf rust, LR）和黄锈病（yellow rust, YR）分别由小麦叶锈菌（Puccinia triticina）和条形柄锈菌小麦专化型（Puccinia striiformis f. sp. tritici）引起，严重威胁产量与品质。传统抗性基因多为小种特异性，易被病原菌新小种克服，因此急需从种质资源中发掘新的抗性位点，以拓宽抗性遗传基础并保障抗性持久性。研究人员利用德国联邦外迁基因库（IPK）提供的1984份春小麦种质，结合高通量离体叶片表型鉴定和基因分型测序（GBS），通过多种全基因组关联分析（GWAS）模型，系统解析了幼苗期对两种锈病的抗性遗传基础，鉴定出稳定的标记-性状关联（MTA）及候选基因，并筛选出携带多个有利等位基因的优良种质，为小麦抗锈育种提供了重要资源。

研究人员首先采用Macrobot半自动化高通量表型平台，对1984份春小麦进行离体叶片接种鉴定，分别使用叶锈菌强致病力分离系77WxR和黄锈菌分离系WxYr27，以Borenos和Akteur作为感病对照。通过线性混合模型计算最佳线性无偏估计（BLUE），并估计方差组分和广义遗传力（H²）。基因分型采用双酶切（PstI/MspI）GBS策略，共获得1,021,664个标记，经质控和填补后保留90,283个高质量标记。群体结构通过STRUCTURE软件和主坐标分析（PCoA）确定，最优亚群数K=3。随后，研究人员使用TASSEL、GAPIT、FARMCPU和GenABEL四种GWAS模型进行关联分析，以LOD≥3且四种方法均检出的MTA作为可靠位点，并根据全染色体连锁不平衡（LD）衰减（±2.6 Mb）界定QTL区间。最后，基于中国春参考基因组（RefSeq V2.1）注释筛选候选基因。样本队列来源于德国联邦外迁基因库，涵盖65个国家，其中亚洲1,040份、欧洲432份、美洲207份、非洲215份、澳大利亚和大洋洲28份、未知来源62份。

**小麦幼苗对P. striiformis f. sp. tritici和P. triticina的反应**
对1984份基因型的表型分析显示，叶锈病和黄锈病感染面积的BLUE值均呈连续单峰分布，符合多基因控制的数量性状特征。与感病对照相比，1,323份基因型对叶锈病表现出较低感染率，1,287份对黄锈病表现出较低感染率，其中875份对两种病害均表现较低感染。叶锈病与黄锈病的BLUE值呈显著但较弱的正相关（r=0.14，p<0.001），表明两者的抗性遗传基础大部分独立。方差组分分析显示，叶锈病广义遗传力H²=0.54，黄锈病H²=0.38，黄锈病更高的残差方差可能与其较长的培养周期和叶片衰老等技术因素有关。

**基因分型、过滤与群体结构**
GBS标记经缺失率（≥30%）、MAF（≤1%）和杂合度（≥10%）过滤后，保留90,283个标记用于GWAS。基于15,771个信息标记的STRUCTURE分析确定最优K=3。K1主要由南亚和东亚基因型组成（97.7%来自亚洲），K2以西亚（伊朗）和非洲为主，K3分布较均衡（欧洲38.6%、亚洲20.5%、美洲19.3%）。PCoA前两个主坐标分别解释4.6%和2.9%的遗传变异。

**全基因组关联分析（GWAS）**
四种GWAS方法共检测到叶锈病峰值标记130、69、45和66个（TASSEL、GAPIT、FARMCPU、GenABEL），黄锈病相应为100、92、52和110个。四种方法共同检测到的叶锈病MTA有6个，位于3B、4B、4D（两个）、5A和7D染色体；黄锈病MTA亦有6个，位于1D、2B、4A、5B和6B（三个）染色体。这些共同峰为稳定可靠的关联位点。与已报道QTL比较，黄锈病4个MTAs与已知区域重叠，而叶锈病6个MTAs均位于未报道的新区域，可能是新发现的抗叶锈病位点。在共同标记附近共鉴定到12个高置信候选基因（黄锈病和叶锈病各6个），其中部分基因注释涉及富含半胱氨酸的受体激酶（CRK）、NBS-LRR蛋白、碱性螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子和受体激酶1等，参与病原识别和防御信号转导。

**可靠抗性相关位点的鉴定**
根据表型筛选，分别有113份（黄锈病）和50份（叶锈病）基因型表现出低于对照的感染水平，其中6份基因型同时携带对两种锈病有利的等位基因，起源于欧洲、亚洲和美洲。这些携带多个有利等位基因的种质可作为亲本，通过聚合育种提高抗锈性的持久性。

讨论指出，幼苗期抗性鉴定存在一定的局限性，例如仅使用单一分离系、无法反映田间病原多样性，需要结合多分离系和成株期田间试验进行验证。与冬小麦相比，春小麦群体在抗性等位基因分布上可能存在差异，本研究结果仅代表春小麦种质的一部分。此外，黄锈病较低的遗传力可能降低检测功效，但采用四种方法共同验证降低了假阳性风险。候选基因的功能注释提示它们可能通过模式识别受体、MAPK级联、活性氧产生和防御基因转录重编程等机制参与抗病反应，但这些关联尚需精细定位和功能验证才能确证因果关系。

**结论**
本研究证明了将高通量表型分析、基因分型数据与多种GWAS模型相结合，能够有效解析春小麦对黄锈病和叶锈病抗性的遗传结构。通过对1984份遗传资源的分析，利用四种互补的GWAS方法鉴定出两种病害稳定可靠的标记-性状关联，其中包括多个新位点。同时使用多种GWAS方法增强了MTA的可靠性，减少了方法依赖性偏差。此外，鉴定到多个同时积累未知黄锈病和叶锈病抗性QTL的基因型，显示了实现稳定抗性的潜力。这些结果不仅拓展了对小麦锈病抗性遗传基础的认识，也展示了高通量GWAS平台在发掘新抗性位点和优良种质方面的实用价值，可应用于小麦育种计划。