培养介质改变视网膜类器官生理学，促进AAV转导和视网膜神经节细胞存活

《Gene Therapy》：Culture media alter retinal organoid physiology promoting AAV transduction and retinal ganglion cell survival

　　

人诱导多能干细胞（iPSC）来源的视网膜类器官为遗传性视网膜疾病（IRD）基因治疗提供了与人体相关的平台，但在体外实现稳健的AAV转导仍具挑战性。研究人员在此证明，在BrainPhys?（BP）培养基中培养可显著增强AAV介导的基因递送。在转导窗口期短暂暴露于BP可提高摄取，而持续BP培养产生最强效应，表明急性进入过程和长期细胞重塑均有贡献。定量蛋白质组学揭示病毒进入和运输介导因子的协调上调，包括形成αVβ5的整合素以及反式高尔基体进入因子GPR108，同时内体/ER-高尔基体运输蛋白富集，为增强的载体加工提供了机制基础。BP同时促进神经元成熟和代谢，神经营养和突触蛋白显著增加，氧化磷酸化组分广泛增强。功能性钙成像显示各条件下神经元动力学相当，但在BP下观察到稳健、反复的网络水平爆发，与增强的连接性一致。BP还保留视网膜神经节细胞并维持经典标志物表达，与以BDNF为中心的相互作用组和改善的环路整合相符。总之，这些发现确定培养环境是人视网膜组织模型中AAV功效的关键决定因素，并将BP定位为一种简单、可扩展的策略，可减少载体需求、增强视网膜细胞靶向性，并提高用于IRD基因治疗开发的类器官非动物测试的保真度。

遗传性视网膜疾病（IRD）是全球不可逆视力丧失的主要原因，基因治疗是最有前景的策略之一。重组腺相关病毒（AAV）载体因安全性、多细胞靶向性和不断增长的临床记录，成为眼部基因递送的首选平台。尽管衣壳工程、启动子优化和临床转化取得进展，但在多能干细胞（PSC）来源的人视网膜类器官中实现高效AAV转导仍是重大挑战。视网膜类器官可模拟人视网膜的细胞多样性、分层结构和发育轨迹，为疾病建模和治疗筛选提供了平台；然而，现有转导效率低、批次差异大，往往需要极高的病毒滴度，这限制了其在载体评估和个性化筛选中的应用。培养环境对病毒转导的影响此前很少受到关注。研究人员在脑类器官中曾观察到BrainPhys?（BP）培养基可提高报告基因表达。BP培养基模拟脑脊液的离子与代谢组成，可支持神经元生理、突触活性和线粒体生物能量学。由于AAV摄取、胞内运输和转基因表达依赖能量机制，增强代谢活性可能提高AAV转导效率。此外，视网膜类器官长期培养中视网膜神经节细胞（RGC）会发生进行性退化，而BP培养基含有BDNF等神经营养因子，可能改善RGC存活。为此，研究人员开展了本研究。

该研究比较了人iPSC来源视网膜类器官在BP与标准ALT90培养基中的AAV转导效率，结合定量蛋白质组学、流式细胞术、数字PCR、免疫组化和钙成像等手段，发现BP培养不仅显著提高AAV介导的基因递送，还同时促进RGC存活和神经元网络功能整合。这些发现确定培养环境是AAV在人类视网膜组织模型中功效的关键决定因素，并将BP定位为一种简单、可扩展的策略，可减少载体用量、增强视网膜细胞靶向性，并提高类器官非动物测试的保真度。论文发表于《Gene Therapy》。

关键技术与方法方面，研究使用了四种多能干细胞系，包括WiCell人胚胎干细胞系WA09.CRX.tdTomato和WA07 A81.BRN3B-P2A-mCherry，以及欧洲认证细胞培养库（ECACC）的人iPSC系HPSI0314i-hoik_1和149br.CRX.mcherry。视网膜类器官分化至13周后转用ALT90或BP培养基。主要技术方法包括：使用不同衣壳/启动子组合（如AAV2/7m8.CMV.GFP、AAV2/5.CMV.GFP、AAV2/8.CBA.GFP、AAV-DJ.CBA.GFP、AAV2/M4.GRK.GFP、AAV2/7m8.2.1.GFP、AAV2/7m8.hSyn.gCaMP6f）进行AAV转导；流式细胞术检测GFP阳性细胞比例和平均荧光强度；数字PCR（dPCR）测定载体基因组拷贝数（VCN）；TMT标记定量蛋白质组学结合LC-MS/MS及STRING蛋白互作网络分析；免疫组织化学鉴定细胞类型；AAV介导的gCaMP6f钙成像分析神经元活动。

研究结果如下：

**BP培养基显著增强视网膜类器官中AAV介导的基因递送**：通过流式细胞术定量，BP培养使AAV2/7m8.CMV.GFP的GFP阳性细胞比例从ALT90的24.1%提高到41.4%（p=0.0233），AAV2/5.CMV.GFP也显著增加（29.4% vs 11.3%，p=0.0043），AAV2/8和AAV-DJ呈相同趋势。免疫组化显示，BP条件下GFP表达不限于光感受器，还共定位于HuC/HuD+内层视网膜神经元；AAV2/M4.GRK.GFP在BP中与RHO+视杆和ARR3+视锥的共定位明显增多。

**蛋白质组学分析揭示病毒进入和AAV胞内运输相关通路富集**：TMT蛋白质组学共鉴定7142个非冗余蛋白，BP中有566个蛋白上调、286个下调。GO分析显示整合素结合、病毒受体活性、细胞粘附分子结合等通路显著富集；ITGAV、ITGB5（形成αVβ5共受体）、CD9、CD81、GPR108、STX8、BCAP29/31等病毒进入和转运相关蛋白上调。短时BP暴露（仅转导窗口72h）即可显著增强转导，但持续BP培养效果更强。dPCR显示BP组VCN显著高于ALT90（323±72 vs 165±9，p=0.0207）。

**线粒体和能量代谢通路富集**：BP上调多种SLC家族转运体、抗氧化蛋白及氧化磷酸化组分（如MT-CO1、MT-CYB、NDUFA4、NDUFB3、UQCRQ、ATP5MD等），表明BP使类器官处于更高能量需求、更活跃的代谢状态。

**神经发生通路富集**：BDNF是最显著上调的蛋白（约8倍），突触蛋白SYT2（4.9倍）、SYNPR（3.8倍）等也显著升高。STRING网络显示以BDNF为中心的突触成熟和神经元分化蛋白群。免疫组化证实BP中SYP（突触素）斑点状表达增强，MAP2阳性的神经突组织更丰富。

**视网膜神经节细胞在BP培养条件下存活改善**：利用Brn3b.mCherry报告系，流式细胞术显示ALT90中RGC比例从16周的21.9%降至26周的4.7%，而BP在26周时仍保留15.9%。免疫组化显示BP中存在RBPMS+和SNCG+ RGC，而ALT90中几乎缺如。

**BP增强神经元网络连接**：gCaMP6f钙成像显示单个神经元的钙瞬变幅度、形状和频率在两种条件下相似，但BP类器官表现出更频繁、更同步的周期性网络爆发，提示RGC和无长突细胞等神经元群体间的功能连接增强。

讨论部分指出，BP可能通过多环节机制发挥作用：上调αVβ5整合素和GPR108等促进病毒附着和细胞内运输；增强氧化磷酸化提供能量支持；以BDNF为中心的神经营养信号维持RGC存活并促进突触成熟；网络同步性增强可能反映RGC介导的环路整合改善。总之，BP添加是一种非遗传、简单可扩展的策略，通过激活特定病毒进入途径、增强内体-高尔基运输、提高代谢能力、保留神经元群体并促进功能性环路整合，为提高AAV转导效率和改进人视网膜类器官基因治疗测试提供了多方面的机制基础。随着基因治疗在眼部和神经适应症中持续扩展，在PSC来源类器官中建立稳健的AAV递送方法，对于优化载体设计、剂量策略并最终改善患者治疗结局至关重要。