使用starPEG-肝素水凝胶的胰腺癌类器官-巨噬细胞共培养揭示肿瘤-免疫细胞相互作用

《npj Precision Oncology》：A pancreatic cancer organoid-macrophage co-culture using starPEG-heparin hydrogel deciphers tumor-immune cell interactions

　　

巨噬细胞是胰腺导管腺癌（PDAC）肿瘤微环境（TME）中最丰富的免疫细胞之一，在调节促进肿瘤生长的免疫抑制微环境中发挥关键作用。尽管近期使用患者来源材料的三维（3D）培养系统推进了我们对肿瘤生物学的理解，但大多数模型缺乏关键的细胞性TME组分，因此无法捕捉肿瘤-免疫细胞相互作用。为弥补这一空白，研究人员开发了一种体外3D共培养模型，将PDAC患者来源类器官（PDOs）与巨噬细胞包封于合成水凝胶基质中。通过调整培养基和基质条件，研究人员优化了培养条件以支持两种细胞谱系。流式细胞术和转录组学分析显示，初始未分化的巨噬细胞在starPEG-肝素水凝胶中暴露于PDAC PDOs后呈现M2样表型，与匹配的原发PDAC组织中通过多重免疫组织化学观察到的巨噬细胞表型一致。细胞因子分泌组谱分析揭示了PDO特异性差异，表明存在不同的巨噬细胞极化亚型。总之，基于starPEG-肝素水凝胶的3D共培养能够开展假设驱动且具有生理相关性的肿瘤-巨噬细胞相互作用研究，并可能推进PDAC患者的免疫调节治疗策略。

胰腺导管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma, PDAC）是最常见的胰腺癌亚型，其标志性特征为促结缔组织增生和免疫抑制性肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）。肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages, TAMs）是PDAC TME中最丰富的免疫细胞群体，通过抑制抗肿瘤免疫、促进血管生成和重塑细胞外基质等方式促进肿瘤进展，并与不良预后和化疗耐药密切相关。尽管患者来源类器官（patient-derived organoids, PDOs）已成为重要的临床前工具，但传统PDO培养多为上皮来源，缺乏TME中的关键细胞组分，难以再现肿瘤-免疫细胞之间的动态相互作用。为填补这一空白，研究人员开发了一种基于合成starPEG-肝素水凝胶的3D共培养模型，将PDAC PDOs与巨噬细胞共同包封于化学成分明确、可调控的基质中，用于解析肿瘤细胞与巨噬细胞的互作机制。该研究通过优化培养基和基质条件实现了两种细胞的长期共存，并结合流式细胞术、转录组学、多重免疫组织化学（multiplex immunohistochemistry, mIHC）和细胞因子分泌组分析，揭示了肿瘤细胞驱动巨噬细胞向M2样/TAM样表型极化的机制。研究结果表明，该3D共培养模型能够重现PDAC TME中的免疫抑制特征，为机制研究和免疫调节治疗策略的筛选提供了生理相关且完全定义的人源化平台。论文发表在《npj Precision Oncology》。

研究人员运用的主要关键技术方法包括：使用来自9例治疗初治PDAC患者的手术组织进行mIHC和图像定量分析，并从中建立4例长期培养的PDO系；巨噬细胞分别来源于PDAC患者外周血单个核细胞（用于条件优化）和3名健康供体G-CSF动员白细胞分离术产物（用于共培养实验）。核心方法包括：基于Opal多重免疫荧光和QuPath的mIHC定量分析；PDO三维培养及靶向测序；单核细胞分离、M-CSF诱导分化为M0巨噬细胞及化学诱导M1/M2极化；将PDO与巨噬细胞以1:2比例包封于starPEG-肝素水凝胶中进行3D共培养；流式细胞术检测巨噬细胞表面标志物；RNA测序结合DESeq2进行差异基因表达分析；基于蛋白芯片的细胞因子分泌组谱检测。

**mIHC揭示PDAC微环境中M2样巨噬细胞富集**：研究人员对9例PDAC原发组织进行mIHC和定量图像分析，发现CD68⁺CD206⁺和CD68⁺CD163⁺细胞为主要巨噬细胞群体，而CD68⁺IRF8⁺ M1样细胞稀少；所有巨噬细胞亚群在间质中的密度显著高于导管区域，M2/M1比值显著偏向M2样，证实PDAC中M2样巨噬细胞是主要的肿瘤内巨噬细胞群体。

**建立用于3D水凝胶共培养的PDAC PDOs**：从匹配的PDAC组织中成功建立4例PDO系（DD1391、DD1970、DD1404、DD1804），各系形态异质性明显，均表达上皮标志物CK19，并携带TP53和KRAS突变，部分系还有SMAD4、ERBB2、CDKN2A等改变，反映了PDO的分子异质性。

**优化培养基条件使PDAC PDOs和巨噬细胞共同生长**：研究人员发现标准PDAC类器官培养基和巨噬细胞培养基对两种细胞相互排斥，因此设计了共培养基（co-culture medium, CCM）。在该培养基中，PDO的形态和活力与标准条件无显著差异，巨噬细胞的活力、凋亡指标与标准巨噬细胞培养基相当，证明CCM可同时支持两种细胞存活。

**starPEG-肝素水凝胶支持PDO和巨噬细胞的3D共培养**：PDO在水凝胶中保持3D结构和增殖活力，对化疗药物的敏感性与Matrigel中基本一致；巨噬细胞在水凝胶中形态和活力未受影响，且化学诱导的M1/M2表型可正常建立。改变水凝胶刚度（γ=0.75、1.0、1.25）未显著影响共培养中巨噬细胞的CD80/CD206表达，提示PDO来源信号是驱动极化表型的主要因素。

**3D共培养揭示肿瘤驱动的巨噬细胞极化**：将健康供体来源的M0巨噬细胞与4种PDO在starPEG-肝素水凝胶中共培养后，流式细胞术显示CD80表达普遍低水平，而M2样标志物CD206和CD200R显著上调，CD163在共培养条件下升高；共培养后的巨噬细胞表型明显不同于化学诱导的M1和M2对照，且极化模式在不同巨噬细胞供体间可重复，表明肿瘤内在异质性塑造了巨噬细胞的免疫表型。

**转录组分析揭示共培养巨噬细胞的TAM和M2极化特征**：RNA测序和差异表达分析显示，与PDO共培养的巨噬细胞中M2标志物MRC1和TAM标志物CD163显著上调，而M1标志物IRF8和M2标志物CD200R1变化不一致；基于实验极化巨噬细胞基因集的富集分析表明，共培养中的差异基因显著富集于M2极化方向（优势比11.9），且从第3天到第7天仍持续向M2方向偏移。TAM相关基因（如TREM2、SIGLEC10、CNRIP1、MMP9）与CD163、MRC1聚类接近，提示共培养诱导了与TAM相关的转录特征。

**个体共培养系显示一致的巨噬细胞极化行为**：对每个PDO系单独分析，发现四个共培养系均显著上调MRC1，其中三个系显著上调CD163；基于M2/M1差异基因的优势比分析显示四个细胞系的共培养均一致偏向M2极化，进一步支持肿瘤诱导的M2样/TAM样极化具有跨系一致性。

**细胞因子分泌组分析揭示PDO特异性巨噬细胞功能**：对DD1391和DD1970两个共培养体系进行细胞因子芯片分析，发现两者均降低M1相关细胞因子（TNF-α、IL-12p40）。DD1391共培养上清中TGF-β1、VEGF、PDGF-BB、IL-6、oncostatin M、LIF和IL-4升高，呈M2/TAM样免疫抑制和促血管生成特征；DD1970共培养上清则以IL-10、MCP-1（CCL2）、GRO-α（CXCL1）、IL-8（CXCL8）、ENA-78（CXCL5）、MIP-3α（CCL20）、血管生成素和TIMP-1升高为主，提示IL-10主导的免疫抑制和趋化因子相关特征。该结果在蛋白质水平证实了PDO驱动的巨噬细胞极化存在肿瘤系特异性差异。

在讨论部分，研究人员指出PDAC的TME中TAMs与不良预后相关，本研究的mIHC结果与单细胞和空间转录组研究一致。共培养中上调的TREM2和SIGLEC10等TAM相关基因已知参与免疫抑制和“别吃我”信号，可作为潜在治疗靶点。基质刚度在测试范围内未显著影响巨噬细胞极化，而肿瘤分泌因子是主要驱动因素，这与既往机械敏感性研究不同，可能与水凝胶的粘附配体和细胞因子螯合特性有关。该平台的优势在于能够选择性地解析肿瘤细胞与巨噬细胞之间的因果关系，并可用于测试TAM重编程、单核细胞募集抑制、CSF1R阻断和CD47/SIRPα检查点阻断等策略。未来工作将纳入CAFs、T细胞、内皮细胞以及患者自体巨噬细胞，以进一步提高生理相关性。

研究结论部分可概括为：这项工作提出了一个概念验证的3D PDAC类器官-巨噬细胞共培养模型，该模型在完全定义的starPEG-肝素水凝胶中重现了胰腺TME的整体免疫抑制特征。通过将人PDO-巨噬细胞相互作用从更复杂的多细胞微环境中分离出来，该平台提供了一个明确且易于实验操作的工具，用于剖析肿瘤-髓系细胞通讯并揭示巨噬细胞教育的候选机制。更重要的是，该3D平台被视为一种具有人类相关性且成本效益高的补充工具，可用于在体内及资源密集型评估之前进行假设检验和巨噬细胞靶向治疗的预筛选。未来工作将聚焦于该平台的转化应用，以识别潜在治疗靶点、增强抗肿瘤免疫并支持个性化治疗策略。