Staphylococcus aureus脂质II翻转酶的结构

《Journal of Biological Chemistry》：Structures of the lipid II flippase from the monoderm pathogen Staphylococcus aureus

　　

摘要
肽聚糖生物合成需要膜翻转酶将脂质连接的前体跨细胞质膜转运以进行加工。这一关键步骤由MurJ介导，MurJ是在所有产肽聚糖细菌中保守的脂质II翻转酶。虽然来自双层膜细菌的MurJ已在多种构象状态下获得结构解析，但其单层膜同源物仍未得到表征。单层膜细菌的MurJ同源物表现出显著的序列分歧，却保留相同的脂质II翻转功能，并且是很有前景的抗生素靶点。研究人员在此报道了金黄色葡萄球菌MurJ（SaMurJ）在外向和内向两种构象下的结构。这些结构显示SaMurJ采用保守的MOP家族折叠，并进行与交替通路（alternating-access）机制一致的构象转变。研究结果揭示了双层膜与单层膜细菌之间MurJ对脂质II翻转至关重要的保守和分歧特征，并为探究底物识别和特异性抑制提供了结构框架。

**论文解读：单层膜病原菌金黄色葡萄球菌脂质II翻转酶MurJ的结构研究**

**一、研究背景与科学问题**

肽聚糖（peptidoglycan, PG）是细菌细胞壁的关键组分，其生物合成是一个多步骤过程，涉及脂质连接前体跨膜转运。其中，脂质II（lipid II）作为肽聚糖生物合成的关键前体，在细胞质中合成后，必须被翻转酶（flippase）跨细胞质膜转运至周质侧，才能被整合到肽聚糖网络中。负责这一关键步骤的是MurJ蛋白，它在所有产肽聚糖细菌中保守存在。尽管来自双层膜（diderm）细菌的MurJ已在多种构象状态下获得结构解析，但其单层膜（monoderm）细菌的同源物在结构上一直未被表征。此前研究曾发现，单层膜细菌中的MurJ同源物（如YtgP）由于序列同源性低，难以通过序列比对进行鉴定，曾经引发长期争议。这些问题凸显了脂质连接前体翻转酶在序列发生显著分歧的情况下仍能保持功能保守的特点，也使得其结构研究更具挑战性。同时，MurJ已被确认是对抗单层膜病原菌（如金黄色葡萄球菌和肺炎链球菌）的抗生素开发的重要靶点，但其结构信息的缺失阻碍了基于结构的抑制剂设计。因此，解析单层膜细菌MurJ的结构对于理解其与双层膜MurJ的异同，以及阐明特异性抑制剂的分子机制具有重要意义。

**二、研究内容概述**

研究人员利用冷冻电子显微镜（cryo-EM）技术，解析了来自金黄色葡萄球菌的MurJ同源物（SAV1754，命名为SaMurJ）分别处于外向和内向两种构象状态的高分辨率结构，并同时获得了未结合配体的大肠杆菌MurJ（EcMurJ）外向构象结构。通过结构比对和功能实验，揭示了单层膜与双层膜细菌MurJ在结构上的保守特征和差异，并通过计算预测和突变分析，鉴定出参与底物识别和结合的关键残基。

**三、主要技术方法**

本研究主要依赖以下关键技术方法：
1. **冷冻电子显微镜（cryo-EM）**：利用ALFA标签/纳米抗体系统或BRIL融合蛋白策略，辅助分子量约55 kDa的SaMurJ和EcMurJ进行高分辨率结构解析。
2. **计算结构预测**：使用AlphaFold对SaMurJ进行初始模型预测；使用Chai-1预测SaMurJ与金黄色葡萄球菌特异性脂质II（lipid II-Gly5）结合的底物结合模型。
3. **进化保守性分析**：利用JackHMMER收集同源序列，CD-HIT聚类去冗余，MAFFT比对，并通过ConSurf计算残基保守性得分并映射到结构上。
4. **功能互补实验**：在MurJ缺失的大肠杆菌菌株（CS7）中表达枯草芽孢杆菌MurJ（BsMurJ）变体，检测其恢复细菌生长的能力。
5. **蛋白质印迹（Western blotting）**：检测MurJ变体在膜组分中的表达水平。

**四、主要研究结果**

**1. SaMurJ外向状态的结构**
研究人员通过ALFA标签系统，在添加抗ALFA纳米抗体作为辅助标记的情况下，解析了SaMurJ^ALFA的3.6 ?冷冻电镜结构。结构显示，尽管双层膜与单层膜MurJ之间的序列同一性仅为17%，SaMurJ仍具有典型的MOP转运蛋白折叠核心，由12个跨膜螺旋（TM）构成，分为N-叶（TM1-6）和C-叶（TM7-12）两个结构域，并含有TM13-14两个额外螺旋，后者构成预测与脂质II聚异戊二烯链结合的沟槽。该结构处于外向开放状态，中央空腔朝向细胞外侧。

**2. EcMurJ外向状态的结构**
为进行比较分析，研究人员利用ALFA标签系统解析了未配体EcMurJ外向状态的3.9 ?结构。该结构与此前报道的嗜热菌TaMurJ外向构象及Sgl结合型EcMurJ结构相似。与已报道的EcMurJ内向结构（PDB: 6CC4）相比，该外向结构揭示了摇摆开关（rocker-switch）机制驱动的刚体运动，包括TM2和TM8向中央空腔移动、TM7伸直、以及TM6-7环向细胞质侧下移以封闭细胞质侧门控。

**3. SaMurJ内向状态的结构**
通过对SaMurJ进行N端7个残基的截短（SaMurJ^8-553）并融合BRIL标签，研究人员解析了SaMurJ内向状态的3.5 ?结构。该结构中央空腔朝向细胞质开放。结构分析显示，SaMurJ中央空腔中存在由K22、R176和K302构成的正电荷三联体（triad），其与EcMurJ中的R18-R24-R270三联体在结构上等价，预测用于协调脂质II头部的二磷酸基团。此外，SaMurJ中央空腔还含有两个额外的带电残基R153（TM4）和E172（TM5）。研究人员还构建了R176A突变体并解析了其结构，发现该突变导致SaMurJ陷入内向构象，支持阳离子三联体在底物识别后诱导构象转变中发挥关键作用。

**4. SaMurJ在脂质II转运循环中的构象转变**
通过对比SaMurJ的内向和外向结构，研究人员发现构象转变主要源于N-叶与C-叶之间的相对刚体运动。在外向转变过程中，TM1向中央空腔移动并关闭跨膜侧向孔道，而TM7发生额外的旋转运动，使TM6-7环相对于膜的位置下移。此外，在外向结构的细胞质门控处观察到E3-K324和K69-D411盐桥，在内向结构的胞外侧门控处观察到R119-D290盐桥，这些相互作用可能用于稳定相应的构象状态。

**5. 单层膜MurJ中预测的底物结合模型**
通过Chai-1计算预测了SaMurJ与金黄色葡萄球菌特异性脂质II-Gly5的结合模型。该模型预测脂质II的十一异戊二烯尾部从TM1和TM8之间的膜孔延伸至TM13-14形成的疏水沟槽，二磷酸基团由K22-R176-K302三联体协调，R153和E172靠近二糖部分，五肽部分位于C-叶远端位点，而五甘氨酸修饰则与Q157和E169残基接触。保守性分析显示，形成二磷酸和二糖结合口袋的残基高度保守，而五肽结合位点保守性较低。功能实验表明，这些保守残基的丙氨酸替换会导致枯草芽孢杆菌MurJ（BsMurJ）丧失互补功能，验证了这些残基对MurJ功能的重要性。

**五、讨论与结论**

本研究的讨论部分指出，单层膜MurJ保留了保守的MurJ折叠，并在内向-外向构象转变中采用类似的双叶交替通路机制，表明该机制在MOP超家族不同翻转酶中可能普遍存在。尽管序列同源性低，SaMurJ与EcMurJ在关键功能特征上保持保守，特别是由正电荷三联体构成的二磷酸结合位点。然而，SaMurJ缺乏双层膜MurJ中保守的G/A-E-G-A基序，而可能依赖TM2中的保守残基G62和P64作为铰链来实现构象转变所需的螺旋弯曲。此外，中央空腔中特有的R153和E172以及其他保守残基（Y49、Y52、Q157、E169、Q173）勾勒出单层膜MurJ在底物识别方面的潜在差异。

研究结论如下：本研究首次解析了来源于单层膜病原菌金黄色葡萄球菌的脂质II翻转酶MurJ在内向和外向两种构象状态下的高分辨率结构，为理解单层膜细菌中脂质II翻转的分子机制提供了结构基础。保守的正电荷二磷酸结合位点可作为广谱抑制剂的靶点，而单层膜特有的结构特征则可能为开发选择性抗生素提供机会。这些结构为靶向细胞壁生物合成关键环节的药物研发提供了路线图。