采用蒸发光散射检测技术的高性能液相色谱法用于测定褐藻中的单糖、甘露醇和氨基糖酸

《Journal of Chromatography A》：High-performance liquid chromatography with evaporative light scattering detection for the determination of monosaccharides, mannitol and uronic acids in brown seaweed

　　•开发了一种新颖的HPLC-ELSD方法，用于检测褐藻中的糖类和尿酸。•报道了甘露糖醛酸和古洛糖醛酸的变旋平衡常数。•在该方法适用的浓度范围内，具有较高的准确性和线性。•该方法已应用于实际的褐藻样本中。•水解过程中的局限性突显了进一步优化的必要性。

### 引言
几个世纪以来，由于其富含生物活性化合物（包括多糖、蛋白质、维生素、脂肪酸和多酚），海藻被不同文化用作食物来源，这些化合物已被证明具有抗病毒、抗肿瘤、抗氧化和抗菌等特性[[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7]]。褐藻特别富含藻酸盐、岩藻多糖、海藻多糖和纤维素等多糖，以及甘露醇、蛋白质、多酚和灰分等其他成分[[8], [9], [10], [11]]。海藻的整体成分因物种、采集时间和生长条件的不同而显著变化[12,13]。在褐藻中发现的多种成分中，多糖因其广泛的工业和生物技术应用而被认为是最有价值的部分，其中藻酸盐在数量和工业价值上尤为突出[14,15]。

藻酸盐是由两种单体组成的线性、非支链的杂多糖：β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）（见图S1）[16,17]。多糖中M/G单体的比例是决定藻酸盐特性的关键因素，因为它影响其凝胶化特性[14,18]。海藻多糖是一种低分子量多糖，是褐藻的主要能量储存形式，其主链由大约2/3的β-1→3吡喃糖单体和1/3的β-1→6分支葡萄糖组成（见图S2a[19]）。其分子量较低（约5 kDa），多糖的还原端可以是甘露醇（M链）或D-葡萄糖（G链）。研究表明，海藻多糖具有抗癌特性，包括抗转移作用和抑制黑色素瘤细胞增殖的作用[20,21]。岩藻多糖是一种异质性的硫酸化多糖，由通过α-(1→2)、α-(1→3)-和/或α-(1→4)-糖苷键连接的各种单糖组成，其结构见图S2b[22]。海藻多糖中的其他单糖如葡萄糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖也使其分子量变化较大（介于7 kDa[22]到2379 kDa[23]之间）。

了解褐藻中的单糖组成对于确定其性质和价值至关重要。上述单糖不吸收紫外线，因此无法直接用HPLC-UV方法进行分析，需要采用衍生化或使用其他检测方法。常用的衍生化方法是水解后的单糖与1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP）反应[24,25]。另一种检测和分离方法是采用脉冲安培检测器（PAD）的高效阴离子交换色谱法（HPAEC-PAD）。HPAEC-PAD基于单糖在高pH值下与强阴离子交换树脂的相互作用进行分离，此时糖分子会被脱质子化并带负电荷[26]。其他分析方法还包括用于测定碳水化合物含量的杜波依斯法（Dubois method）以及用于结构表征的质子核磁共振（1H NMR）[17,[27],[28],[29],[30],[31],[32],[33]。表1总结了目前可用的各种方法及其优缺点。这些方法存在一些局限性：某些方法需要多次分析才能检测所有目标化合物（例如HPAEC），有些无法完全识别和分离所有化合物（例如经过PMP衍生化的HPLC-UV），还有一些无法区分不同的单糖（例如杜波依斯法和1H NMR）。

作为离子交换色谱法的替代方法，亲水相互作用液相色谱法（HILIC）被提出用于有效分离极性化合物和离子化化合物，如碳水化合物[34]、药物[35]、氨基酸[36]和代谢物[37],[38],[39]。HILIC中的分离基于化合物与固定相（通常是吸附在极性固定相表面的富水层）之间的相互作用（亲水分配、氢键和静电作用），这非常适合极性较强的单糖。

由于单糖不吸收紫外线，可以使用蒸发光散射检测器（ELSD）进行检测。ELSD的工作原理分为三个步骤：柱流出的混合物被雾化成气溶胶，然后通过加热的漂移管；溶剂蒸发后，非挥发性分析物被输送到检测单元，光束照射到这些分析物上，光电二极管将散射光转换为电信号。该信号与分析物的大小和质量成正比，但遵循幂律关系而非线性关系，这与UV检测器不同[40]。

### 褐藻中的单糖组成
除了甘露醇外，所有褐藻中的单糖都含有异头碳，因此会发生变旋现象。变旋是指单糖在其α和β异头形式之间的转化导致的旋光性质变化（以D-葡萄糖异头体为例，见图1[45]）。当环状糖溶解在极性溶剂中时，会发生变旋，最终达到两种异头体之间的平衡。例如，在水中溶解的D-葡萄糖在31°C时，α-吡喃糖和β-吡喃糖的比例为38%和62%[47]。只要温度和溶剂保持不变，无论溶液中单糖的浓度如何，这种比例都保持恒定。

由于变旋，单糖在HPLC分离过程中会形成两个独立的峰，这给定量分析和方法开发带来了复杂性。为了分离和检测海藻中的单糖，首先需要对多糖进行水解。水解可以采用酸性条件和高温度（酸水解）、特定酶（酶促水解）[48]、酸性条件和微波（物理辅助水解）[49]或酸甲醇水解[50]等方法实现。不同的糖苷键在水解过程中的分解速率不同，释放出的单糖容易在恶劣条件下发生降解，因此需要根据样品和条件优化水解方法[41,51]。由于褐藻中多糖的复杂性和多样性，水解是分析过程中最容易出错的步骤。由于成分差异，藻酸盐样品和未经处理的褐藻样品所需的水解条件不同。在某些情况下，研究人员通过将每种单糖的浓度乘以相应的校正因子来考虑降解和水解速率[17,52]。这些校正因子是通过测定水解前后每种单糖的浓度来确定的[52]。即便进行了校正，由于样品的复杂性，报告结果仍存在一定变异性。

已建立的褐藻产品酸水解方法包括两步H2SO4水解（NREL方法[53]）、两步HClO4水解[44]或直接TFA水解[54]。Manns等人（2014）比较了这些水解方法，发现两步H2SO4法得到的单糖产率最高，残留物含量最低[44]。两步HClO4水解在残留物含量方面略优于TFA水解。然而，用于比较的TFA水解方法并未针对褐藻或藻酸盐进行优化。

使用HPLC-ELSD测量水解物时，必须去除所有非挥发性化合物，因为它们会干扰检测器。虽然H2SO4对褐藻样品的水解效果最好，但去除它需要中和、去除生成的盐分并蒸发，这大大增加了实验的复杂性。相比之下，TFA通过低压蒸发更容易去除。

Lu等人（2015）测试了不同的TFA水解条件，以测定藻酸盐中释放的甘露糖醛酸和古洛糖醛酸，发现由于糖苷键的不同，它们有各自的最佳释放条件[54]。他们在2M TFA、100°C和2.5毫克干燥样品/毫升的条件下，甘露糖醛酸在12小时内完全释放且未降解，而古洛糖醛酸在6小时内释放。在1M TFA、100°C和2.5毫克干燥样品/毫升的条件下，甘露糖醛酸在18小时内完全释放，古洛糖醛酸在12小时内释放。较高的酸浓度或温度会导致多糖和二糖在完全水解之前就发生降解。

本研究旨在开发并验证一种新型HPLC-ELSD方法，以便在一次分析过程中同时检测和定量褐藻中的所有主要单糖、尿酸和甘露醇，从而克服现有最先进方法（HPAEC）的局限性。该方法考虑了变旋的影响，并采用反卷积策略来解决部分化合物的共洗脱问题，同时通过系统验证确保方法的稳定性。研究使用了Ascophyllum nodosum、Alaria esculenta和Fucus serratus三种海藻来验证该方法的适用性。此外，还评估了生物质水解对单糖定量带来的影响。

### 化学试剂与仪器
所有化学试剂均为最高分析纯度。乙腈（HPLC级）购自Filter Service（比利时Eupen）。甲酸铵和L-岩藻糖来自TCI Chemicals Europe（比利时Zwijndrecht）。甲酸、L-鼠李糖、D-半乳糖、D-葡萄糖、D-甘露糖和D-木糖购自Merck（德国Darmstadt）。L-古洛糖醛酸和D-甘露糖醛酸购自Carl Roth（德国Karlsruhe）。

### 校准曲线和线性
如前所述，由于变旋作用，糖混合物中的大多数化合物会分解成各自的异头体。因此，一个化合物可能产生多个色谱峰，一个色谱峰也可能包含多种化合物，这意味着无法仅从单个峰直接获得分析物的总浓度。为了解决这些问题，本章分为两个小节：(i) ELSD响应的一般描述。

### 方法优化和峰分配
如2.3节所解释的，分析是在XBridge Amide柱（2.1×150 mm，粒径3.5 μm）上以30°C进行HILIC模式进行的。选择Amide柱是因为它对目标分析物具有良好的分离效果。在方法开发过程中还评估了另一种HILIC柱（Poroshell HILIC-Z），但Amide相提供了最佳的分离效果。选择了30°C的柱温，因为该温度下基线稳定性较好。

### 结论
开发的HPLC-ELSD方法能够充分分离褐藻中的目标单糖、甘露醇和尿酸。方法验证结果显示，单糖的回收率在84.7%-120.9%之间（其中岩藻糖的两个数据点分别为197%和142%），尿酸的回收率为99.5%-134.8%，所有化合物的平均回收率为102±13.6%。重复性和中间精密度均达到可接受的水平。

### CRediT作者贡献声明
Roberto Garcia Peran：概念构思、方法设计、数据分析、写作（初稿）。Nick Sweygers：概念构思、方法设计、写作、审稿与编辑、监督。Deirdre Cabooter：概念构思、方法设计、监督、写作、审稿与编辑。Lise Appels：概念构思、方法设计、写作、审稿与编辑、资源获取、资金协调、监督。Raf Dewil：概念构思、方法设计、写作、审稿与编辑、资源获取、资金协调。

### 数据可用性声明
数据集可通过KU Leuven的研究数据存储库（RDR）获取，DOI地址为：https://doi.org/10.48804/T5PJN1（数据将在接受后提供）。

### 资金支持
本研究由欧盟（玛丽·居里行动计划项目N° 101073471 [SEACHEM]）资助。然而，所表达的观点仅代表作者本人，并不一定反映欧盟或欧洲研究执行机构（REA）的立场。欧盟和资助机构不对这些观点负责。

### 手稿准备过程中的人工智能和AI辅助技术的使用
在准备过程中，作者使用了Microsoft Copilot辅助文本修订和创意生成。使用该工具后，作者对内容进行了必要的审查和编辑，并对发表文章的内容负全责。此外，还使用了Microsoft Copilot、Google Gemini和Open AI ChatGPT来编写Python代码，用于不同目的，例如生成HPLC色谱图可视化程序和验证代码。

### CRediT作者贡献声明
Roberto Garcia Peran：写作（初稿）、方法设计、数据分析、概念构思。Nick Sweygers：写作、审稿与编辑、监督、方法设计、概念构思。德丽德·卡布特尔（Deirdre Cabooter）：负责写作、审稿与编辑工作，以及研究监督和方法论的制定。丽莎·阿佩尔斯（Lise Appels）：同样负责写作、审稿与编辑工作，此外还负责研究监督、资源调配、方法论的制定以及资金筹措工作。拉夫·德维尔（Raf Dewil）：除了撰写论文、审稿与编辑之外，还参与研究监督、资源调配、方法论的制定，并负责资金筹措工作。作者声明：他们没有已知的潜在财务利益冲突或个人关系，这些因素可能会影响本文的研究结果。

作者名单：罗伯托·加西亚·佩兰（Roberto Garcia Peran）、尼克·斯威格斯（Nick Sweygers）、德丽德·卡布特尔（Deirdre Cabooter）、丽莎·阿佩尔斯（Lise Appels）、拉夫·德维尔（Raf Dewil）