基于微波辅助提取、固相提取/分级、GC-FID 及 UHPLC-APCI-MS 分析的西西里开心果 (Pistacia vera L. var. Bronte) 脂质组学研究

《Journal of Chromatography A》：Lipidomics investigation of Sicilian Pistachio ( Pistacia vera L. var. Bronte) by Microwave-assisted extraction, Solid-phase extraction/fractionation, GC-FID, and UHPLC-APCI-MS analyses

　　

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  对PDO西西里Bronte开心果的脂质组学研究。
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  开心果油的SPE分级分离为TAG、FFA和PLs。
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  酯化和游离脂肪酸的样品管中衍生化过程。
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  完整TAG和PLs物种的UHPLC-APCI-MS表征。
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  对PDO产品深入研究的多种技术方法。

引言

脂质是一类化学上多样化的生物分子，在生物系统中发挥着至关重要的作用，作为能量储存化合物、生物膜的结构成分，以及参与信号传导过程 [1]。这种结构多样性涵盖了广泛的分子，如脂肪酸（FA）、三酰甘油（TAGs）、磷脂（PLs）、甾醇、鞘脂（SLs）、萜类化合物等。鉴于许多脂质基质的高度复杂性和脂质分子广泛的结构多样性，没有任何单一的分析技术能够全面表征样品中所有脂质类别和物种 [2]。因此，为了达到更广的分子覆盖范围，已开发出广泛的色谱方法，通常与质谱（MS）和其他互补检测器联用 [3,4]。

为了降低这种复杂性，对总脂质提取物进行脂质类别预分级是一个至关重要的步骤，因为它通过防止组成差异很大的脂质物种之间的共洗脱，提高了脂肪酸测定的准确性 [[5], [6], [7], [8]]；同时还允许在分析之前对特定脂质类别进行隔离和简化 [9,10]。

这一步在食品分析中尤为相关。不同的脂质类别，如TAGs、PLs和游离（F）FAs，可能呈现出显著不同的FA分布 [11]。当对总脂质提取物在不预先分离的情况下进行分析时，只能获得基质的整体FA分布，而类别特异性FA信息（可能与总分布存在显著差异）可能会丢失。实施脂质类别分级可以提高分析可靠性，确保对食品脂质更具代表性的表征 [12,13]。

在总脂质中PLs含量为0.2–2.0%的食品产品中，强烈建议在分析前去除TAGs和其他中性脂质 [14]。除食品领域外，脂质类别分级在能源领域也越来越重要，在从废物原料生产高级生物燃料时，PLs的去除至关重要，因为PLs会在燃料生产过程中毒化和钝化加氢处理催化剂 [[15], [16], [17]]。

在各种可用的分级技术中，固相萃取（SPE）已被证明对脂质类别分级特别有效，能够产生高度富集的分级且交叉污染极小 [[18], [19], [20]]。它是一种快速、选择性强的广泛使用的样品制备技术。脂质通过非极性、极性或离子交换相互作用保留在吸附剂上，具体取决于相化学，并根据所用溶剂进行选择性洗脱。关于SPE用于脂质分离的不同程序和方法的详细描述，请参阅文献 [21]。

坚果，尤其是开心果，是这种分级特别有价值的食品基质：它们富含脂质——约占其总重量的40%——其分布以单不饱和和多不饱和脂肪酸以及饱和脂肪酸为主；仅油酸（C18:1n9）和亚油酸（C18:2n6）就占总脂肪含量的一半以上。在开心果中，西西里Bronte开心果（Pistacia vera L. var. Bronte）是一种高价值品种，自2010年起在欧洲联盟获得原产地保护（PDO）认证 [22]。尽管其经济和地理意义重大，但其脂质分级，更具体地说是次要脂质类别，在分子水平上仍未得到充分表征。因此，本研究的目标是对通过微波辅助提取（MAE）获得的西西里Bronte开心果原油中的完整脂质进行全面表征，特别关注次要脂质类别，包括游离脂肪酸（FFAs）和磷脂（PLs）。为此，对油样进行了固相萃取/分级（SPEF）以实现脂质类别分级，随后进行互补色谱分析。采用超高效液相色谱（UHPLC）与四极杆质谱仪（qMS）联用，配备大气压化学电离（APCI）接口，在正负两极性模式下运行，用于详细表征非挥发性脂质物种，如TAGs和PLs；而GC用于确定总脂质和每个分离脂质分级（包括FFA分级）的FA组成，以衍生化甲基酯（MEs）的形式。这种组合方法实现了对Bronte开心果油脂质组的稳健且精细的表征。

章节摘要

化学品和试剂

正己烷（hex，99%）、甲醇（MeOH，≥99%）、甲基叔丁基醚（MTBE，≥99%）、异丙醇（IPA，≥99.9%）、甲酸（HCOOH）、正烷烃（从正C7到正C30）、SUPELCO C37脂肪酸甲基酯（FAMEs）混合物、十一烷酸（C11:0）、甲基二十三烷酸酯（Me.C23:0）和氢氧化钾（KOH）均购自Merck（德国达姆施塔特）。氯仿（CHCl₃，≥99.9%）、二乙醚（Et₂O，≥99.8%）、盐酸（HCl，34–37%）、乙腈（ACN，≥99.99%）、硫酸（H₂SO₄

微波辅助脂质提取和SPE分级

脂质提取采用Bellinghieri等人最近报道的参数 [24]。提取过程进行了两次平行操作，获得产率为32.01% ± 2.42，变异系数（CV）为7.57%。与常规提取技术相比，MAE-MTBE显示出了实际优势，包括简化的单溶剂提取、缩短的处理时间（约30分钟）、较低的溶剂消耗量，以及在测试方法中得分最高的绿色评分 [24,27

结论

本研究提供了西西里Bronte开心果油的全面脂质组学表征。通过结合MAE、SPEF与互补的GC-FID、NARP-UHPLC-APCI (+)-MS和RP-UHPLC-APCI(+/?)分析，实现了在单一工作流程内同时研究FA、TAGs和PLs。SPEF提高了分析选择性，减少了共洗脱现象，并使主要和次要脂质类别都能独立研究。虽然APCI-MS通常

CRediT作者贡献声明

Giulia Giacoppo：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，软件，调查，形式分析，数据整理。Carlo Bellinghieri：撰写 – 审稿与编辑，软件，调查。Romain Murian：软件，调查，形式分析。Andrea Schincaglia：软件，调查，形式分析。Luisa Pasti：撰写 – 审稿与编辑，监督，资源。Alberto Cavazzini：撰写 – 审稿与编辑，可视化，监督。Flavio Antonio Franchina：撰写 –

利益冲突声明

作者声明他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系，这些可能影响到本报告中所述的工作。

Giulia Giacoppo|Carlo Bellinghieri|Romain Murian|Andrea Schincaglia|Luisa Pasti|Alberto Cavazzini|Flavio Antonio Franchina|Marco Beccaria