N-烷基吡啶鎓磺酸盐作为多模式高靶向代谢组学中的多用途探针化合物：在湖沼钩虾中的应用

《Journal of Chromatography B》：N-Alkylpyridinium sulfonates as versatile scout compounds for multi-mode highly targeted metabolomics: Application to Gammarus fossarum

　　

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  经济高效的NAPS替代标记化合物用于Scout MRM采集模式。
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  检测方法涵盖3种LC模式（C₁₈、F₅、HILIC），且正负两种极性均可适用。
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  高度多路复用的Scout触发式（stMRM）方法可监测559种代谢物。

引言

代谢组学通过测量细胞过程中产生的小分子，为观察生物体的生理反应提供了独特的窗口，从而直接呈现生物活动的快照。正如Li Liu等人[1]所指出的，这一组学方法已成为评估多种环境污染物毒性效应的有力工具，能够对非靶标生物体底层的毒性机制进行深入探索。例如，在水生态毒理学中，代谢组学已成功应用于Gammarus pulex等哨兵物种，揭示了药物暴露所引发的代谢途径变化，如氧化应激和蛋白质合成受阻[2]。目前，此类生态毒理学研究中常优先采用非靶向方法，以实现对新型代谢物的发现和假说生成。然而，非靶向方法在数据处理方面存在显著瓶颈，尤其是在关键的峰挑选阶段。该步骤需要复杂算法来将真实的代谢特征与背景噪声、伪影及大量分析批次中的重叠同位素包络区分开来，使得数据提取耗时且易产生假阳性[3]。因此，靶向方法因能克服这些局限性而备受关注。通过使用多反应监测（MRM）针对预设的代谢物集合进行聚焦，质谱仪可直接为每种监测的跃迁产生明确的色谱峰。该策略有效规避了随机性峰挑选的难题，将数据处理流程转移至即时且稳健的峰积分，大幅缩短了处理时间并提升了定量可靠性[4]。

尽管靶向质谱是定量特定代谢物的强有力技术，但其多路复用能力仍然有限。监测大量化合物需要采集众多并行的MRM跃迁，这反而会降低占空比并削弱分析重现性。虽然保留时间（RT）调度通过限制扫描至预期的狭窄洗脱窗口来缓解这一问题，但其极易受到色谱漂移的影响。液相色谱（LC）系统、流动相或复杂生物基质中的微小变化往往导致预期峰移出其调度的窗口。因此，这些漂移需要耗资巨大且耗时费力的重新分析或方法开发。在水生态与环境监测中，由于需要处理大规模样本队列，这些色谱漂移构成了关键的瓶颈。如此庞大的分析序列会加速固定相降解和柱污染，导致系统反压逐渐升高，迫使靶峰移出狭窄的预设采集窗口。此外，生态毒理学代谢组学研究经常涉及跨物种比较或器官特异性分析，例如从Gammarus的高度特化组织——消化道盲肠转向全生物体提取物。这些转变引入了严重的基质差异，直接改变保留行为，使峰裁剪的风险大幅上升。为克服定时采集的局限性，我们此前提出了Scout触发式MRM（stMRM）采集模式（图1）[5]、[6]、[7]。该模式的主要突破在于其能够消除对定时保留窗口的需求。Scout分子是分布在色谱图全过程中的一组化合物，每个分子单独控制一个跃迁组的触发。每个跃迁组因此由两个Scout分子界定。当某一Scout的信号强度超过用户设定的阈值时，便触发对该跃迁组的监测，同时停止前一个跃迁组的监测，依此类推。这一创新流程具有显著优势：(i)简化检测方法构建：只需将目标分子置于两个Scout之间即可轻松构建多路复用检测方法；(ii)采集不再依赖保留时间，对意外漂移的抗干扰能力更强，并便于实验室间方法转移[8]；(iii)提升多路复用能力[9]。

Scout化合物的选择是stMRM方法开发中的关键步骤。这些标记物分为两大类：(i)有意引入样本的外源化合物和(ii)样本基质中天然存在的内源化合物。外源方法在实施方面具有明显优势。该方法涉及向样本中补充原本不存在的化合物，尤其是同位素标记分子[5]、[6]、[7]、[9]。通过战略性选择，该方法能够实现对保留范围的全面覆盖而不遭遇干扰问题。此外，通过精确调节外源化合物浓度来调节Scout信号的能力，增强了Scout组检测的稳健性。相反，内源stMRM依赖所有样本中固有存在的化合物，需要在不同样本间保持一致的信号模式。该方法面临若干技术挑战，所选标记物必须保持稳定并能抵抗基质干扰或杂质影响。在代谢组学中，这些限制尤为棘手，因为大量化合物具有相同的质谱特征和MS跃迁。由于这种巨大的结构多样性，代谢组学中的LC/MS/MS分析通常采用电喷雾（ESI）的正负离子化模式和/或大气压化学电离（APCI）进行。因此，必须针对每种离子化模式添加特定的Scout化合物。此外，代谢组学中的色谱环境涵盖多种关键分析方法。反相色谱（RPLC）仍是分离非极性和中等极性代谢物的主导方法，而亲水相互作用色谱（HILIC）则作为极性化合物分析的补充手段应运而生。多种色谱模式和离子化源的存在使Scout选择过程复杂化。此外，所需参考化合物的数量——尤其是同位素标记化合物——会显著增加分析总成本。

为满足对通用且经济高效的Scout系统的需求，本文评估了在stMRM代谢组学中使用N-烷基吡啶鎓磺酸盐（NAPS）的可行性。该系列两性离子标准品最初由加拿大国家研究委员会（NRCC）的M.A. Quilliam作为认证参考物质（RM-RILC）引入[10]，随后由Renaud等人评估用于对96种霉菌毒素和真菌代谢物的保留时间进行标准化，证明基于NAPS的索引系统能够改善化合物鉴定、减少假阳性并促进实验室间数据共享[11]。NAPS保留指数系统随后被Stoffel等人[12]应用于RP-LC-MS代谢组学，而Kelman等人近期开展的一项国际实验室间验证研究确认了其在多样化LC-MS平台上标准化保留行为的能力[13]。NAPS具有永久带电的四价胺和磺酸基团，在色谱中分布良好，且在正负两种极性下均可高效电离[12]。以往研究将NAPS用于采集后的保留时间索引和数据标准化，而本研究则将这类两性离子化合物重新用作三种互补分离模式下的实时主动采集触发器：传统反相C₁₈、亲水相互作用色谱（HILIC）以及五氟苯基丙基（F₅）核壳相。

随后，我们将这一稳健的方法应用于研究哨兵端足类Gammarus fossarum暴露于银（Ag）后消化道盲肠中的器官特异性代谢特征，旨在更深入地了解污染物诱导的生理应激反应。

章节摘要

化学品与试剂

水、乙腈（ACN）、甲醇（MeOH）和溶剂购自Fisher Scientific（LC-MS级）。乙酸铵、甲酸、乙二胺四乙酸（EDTA）、Trizma盐酸盐、氢氧化钠、Triton X-100、二氯甲烷（DCM）、甲基叔丁基醚（MTBE）、氯化钠、氨肽素、碳酸氢铵和氯肽素盐酸盐（均为分析纯）购自Sigma Aldrich（法国圣昆滕-法拉维耶尔）。Splash Lipidomix（Avanti Polar Lipids）以及

Scout选择

在代谢组学中，全面分析通常需要同时采集电喷雾和/或APCI正负离子化模式的数据，以涵盖代谢物多样的物理化学特性。因此，理想的外源Scout应能在两种极性下高效电离，避免需要为每种模式单独添加一组化合物，因为这会复杂化样本制备并稀释样本。离子化模式的选择取决于化学

结论

本研究报道了一种适用于不同色谱分离的正负两种极性的高度多路复用Scout-MRM方法的开发。据我们所知，这是首次将N-烷基吡啶鎓磺酸盐作为Scout化合物用于RPLC和F₅。我们的方法能够实现对众多代谢物的全面检测。我们将该方法应用于研究鳃足类消化道盲肠在银暴露下的生物反应。分子特征是

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CRediT作者贡献声明

Remy De Boni：撰写—审阅与编辑，撰写—原稿撰写，方法学，调查研究，形式化分析。Delphine Arquier：撰写—原稿撰写，调查研究，形式化分析。Sophie Ayciriex：撰写—审阅与编辑，调查研究。Arnaud Chaumot：资源。Davide Degli-Esposti：撰写—审阅与编辑，资源，方法学。Olivier Geffard：撰写—审阅与编辑，资源。Arnaud Salvador：撰写—审阅与编辑，撰写—原稿撰写，监督，项目

利益冲突声明

作者声明，他们不存在已知的可能与本文所述工作产生利益冲突的财务关系或个人关系。

致谢

作者感谢法国高等教育、研究与创新部（Ministère de l'Enseignement Supérieur, de la Recherche et de l'Innovation）为Rémy De Boni提供的博士学位奖学金。本研究得到法国国家环境卫生与健康研究计划（Anses，2023-EST-077）的支持。

Remy De Boni|Delphine Arquier|Sophie Ayciriex|Arnaud Chaumot|Davide Degli-Esposti|Olivier Geffard|Arnaud Salvador