磷酸镓纳米颗粒作为对抗铜绿假单胞菌肺部感染的无抗生素策略

《Journal of Colloid and Interface Science》：Gallium phosphate nanoparticles as an antibiotic-free strategy against Pseudomonas aeruginosa lung infections

　　

摘要

细菌耐药性的不断上升和现有抗生素疗效的下降，迫切需要开发新的抗菌策略。镓离子是三价铁离子的类似物，能够干扰细菌的铁稳态。然而，如何将其有效递送至肺部感染部位仍是一大挑战。本研究报道了一种无抗生素的抗菌方法，利用磷酸镓（GaP）纳米颗粒实现抗菌效果。我们首次采用一种具有工业应用价值的制造过程——火焰喷射热解（FSP），制备了组成可控（Ga:P比例）且平均粒径在9至23纳米之间的GaP纳米颗粒。GaP纳米颗粒对肺感染的主要病原体铜绿假单胞菌表现出强效的抗菌活性，即使在铁丰富的条件下也能抑制浮游细菌的生长并阻止生物膜的形成。GaP纳米颗粒与人肺上皮细胞具有良好的生物相容性，且在小鼠体内经肺部给药后未引起组织病理学方面的不良反应。在小鼠肺部感染模型中，经鼻给药GaP纳米颗粒可显著降低细菌负荷。本研究确立了火焰法制备的GaP纳米颗粒作为对抗铜绿假单胞菌肺部感染的可规模化、无抗生素策略，并为火焰法制备的GaP纳米颗粒作为精准感染纳米医学新范式奠定了基础。

引言

下呼吸道感染仍然是世界卫生组织（WHO）认定的全球主要健康问题和死亡首要原因之一。2021年，除COVID-19外，此类感染导致的死亡人数超过200万[1], [2]。此外，抗菌药物耐药性的不断上升以及新抗生素研发进展停滞，正在削弱现有抗生素的疗效[3], [4], [5]。铜绿假单胞菌是一种臭名昭著的病原体，因其对多种抗生素具有内在耐药性而被WHO列为优先病原体[6], [7]。作为革兰氏阴性菌，铜绿假单胞菌具有双膜结构，需要将抗生素递送至胞质内须经历多步过程并涉及多种转运系统，导致胞内药物积累量低[8], [9], [10]。此外，其外膜上的非选择性孔蛋白通道数量较少，进一步限制了抗生素的进入，降低了治疗效果[11], [12]。重要的是，铜绿假单胞菌易于形成生物膜，这在慢性伤口感染和囊性纤维化患者的肺部中十分普遍[13]。与浮游状态相比，生物膜的形成大大增强了细菌对抗生素的耐受性，并与毒力增强有关[14]。

为应对新型革命性抗生素匮乏这一紧迫问题，一种有前景的治疗策略是通过限制病原体的铁供应来进行营养干扰。铁是几乎所有细菌不可或缺的必需元素，它作为呼吸、中央代谢及其他关键细胞过程中所需酶的必需辅因子[15]。然而，在人体中，铁在生理条件下受到严格调控，被整合到含铁蛋白中，如转铁蛋白、乳铁蛋白和血红素，从而阻止细菌获取铁[16]。面对这一挑战，细菌产生并分泌铁螯合分子——铁载体，以更高亲和力从宿主蛋白中夺取铁，并将负载了铁的铁载体转运至细菌膜上的特异性膜受体[17]。镓以其离子形式（Ga³⁺）存在，被认为是铁离子（Fe³⁺）的类似物，因为两者在离子半径、电离势和配位几何构型等理化性质上几乎相同[18], [19]。实际上，Ga³⁺与铁载体的结合亲和力更高，能够取代铁-铁载体复合物中的铁[20]。与Fe³⁺不同，Ga³⁺无法参与氧化还原反应，因为它不能被还原为较低的氧化态，这会导致细菌铁稳态被破坏，从而损害细菌增殖。

镓的抗菌潜力已被认识到近一个世纪之久，最早的报道可追溯到1931年，证实了酒石酸镓在兔体内治疗梅毒的生物活性[21]。后续研究进一步确立了镓作为一种有前景的抗菌剂的地位，其优势在于强效的抗菌作用、广谱抗菌活性以及良好的生物相容性[22], [23], [24]。硝酸镓（Ga(NO₃)₃，商品名为Ganite ?）已获FDA批准用于治疗癌症患者的高钙血症，目前正被重新用于细菌感染治疗，一期临床试验正在进行中[24]。与此同时，纳米技术的进步进一步拓展了镓的治疗范围[25], [26]。与块体材料相比，镓基纳米颗粒的大比表面积使其能够高效地与微生物膜相互作用并破坏细菌膜完整性[27], [28]。值得注意的是，这些纳米级镓基颗粒已被证明能够破坏多物种生物膜，凸显了它们作为下一代抗菌平台的潜力[29]。

在本研究中，我们提出了一种利用磷酸镓（Ga_x(PO₄)_y）纳米颗粒治疗肺部感染的新抗菌方法。为简便起见，后文将其简称为GaP纳米颗粒，通过火焰喷射热解（FSP）制备，该方法具有可规模化和可重复的特点。据我们所知，这是首次报道利用FSP制备GaP纳米颗粒用于抗菌应用。我们评估了不同粒径和镓含量的GaP纳米颗粒在体外对铜绿假单胞菌的抗菌活性。研究结果表明，GaP纳米颗粒能够有效抑制浮游细菌的生长并阻止生物膜的形成。我们还通过小鼠肺部感染模型在体内评估了其抗菌活性和生物相容性。为增加感染部位GaP纳米颗粒的局部浓度，采用经鼻给药方式递送纳米颗粒。GaP纳米颗粒的生物相容性在体外使用A549细胞进行评估，并在体内通过组织病理学方法使用C57BL/6 J小鼠模型进行评估。最终，在CD-1小鼠的中性粒细胞减少性肺炎模型中评估了GaP纳米颗粒对铜绿假单胞菌的体内抗菌效果。综合而言，我们的结果表明GaP纳米颗粒在预防和治疗与铜绿假单胞菌相关的肺部感染方面具有广阔前景。

章节摘要

GaP纳米颗粒的合成与表征

GaP纳米颗粒通过火焰喷射热解（FSP）合成[30]。简要步骤如下：将醋酸丙酮羟肟酸镓（99.99%，Sigma-Aldrich）加入到醋酸酐（≥98%，Sigma-Aldrich）和2-乙基己酸（99%，Sigma-Aldrich）的1:1（v/v）混合物中，配制成0.1和0.3 M的镓前驱液。将溶液在80°C下回流至少30分钟，以确保醋酸丙酮羟肟酸镓完全溶解。随后，取适量体积的

磷酸镓（GaP）纳米颗粒的制备与表征

GaP纳米颗粒通过FSP制备（参见图1A中的示意图），其原理是将液态前驱液雾化喷洒，并利用预混合的CH₄/O₂微火焰点燃。为了系统评估FSP工艺参数对GaP纳米颗粒粒径的影响，设计了一种三因素、二水平的实验设计（DoE）方案（请参阅补充材料，SI，图S1）。所研究的变量包括：（i）前驱液中的镓浓度，（ii）分散氧气流量，以及（iii）前驱

结论

本研究证明，利用火焰喷射热解这一高度可规模化、可重复的工艺，可以可靠地制备磷酸镓（GaP）纳米颗粒，并能精确控制颗粒大小和组成。这些纳米颗粒表现出强效的抗铜绿假单胞菌活性，能够抑制浮游细菌生长并阻止生物膜形成。在体外利用人肺上皮细胞进行生物相容性实验以及在小鼠体内经鼻给药后的安全性评估

CRediT作者贡献声明

Yu, S.：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，方法论，形式化分析，数据管理，概念构思。Zhuang, Y.：撰写 – 审阅与编辑，方法论，数据管理。Rondahl, V.：撰写 – 审阅与编辑，方法论，形式化分析。Moorthy, A. N.：撰写 – 审阅与编辑，方法论，形式化分析，数据管理。Maheshwari, A.：撰写 – 审阅与编辑，形式化分析，数据管理。Ramachandran, R. V.：撰写 – 审阅与编辑

利益冲突声明

作者声明不存在任何已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报道的工作。

致谢

本工作得到了欧洲研究委员会（ERC）在欧盟地平线2020研究与创新计划（ERC资助协议编号758705）、卡罗林斯卡学院、瑞典战略研究基金会（SSF）（FFL18-0043和RMX18-0043）、瑞典研究委员会（编号2021-05494、2021-06394、2021-02059、2023-01975和2023-03057）、克努特和阿莉丝·瓦伦贝格基金会以及托尔斯滕·斯约德贝里基金会的资助。卡罗林斯卡学院的3D-EM设施

Yu, S.| Zhuang, Y. | Rondahl, V. | Moorthy, A. N. | Maheshwari, A. | Ramachandran, R. V. | Dookie, R. | Gaborieau, M. | Loh, E. | Aschtgen, M.-S. | Lundberg, C. V. | Henriques-Normark, B. | Sotiriou, G. A.