《Journal of Colloid and Interface Science》：Hierarchically structured electrochemical biosensing interface for real-time monitoring of macrophage polarization
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摘要血清中低丰度生物标志物的直接电化学检测需要同时兼顾灵敏度、抗污能力和生物相容性。本研究构建了一种分级结构生物传感界面AuNRs@PEG@PEDOT:Hep，该界面将垂直排列的金纳米棒阵列结合聚光效应以增强导电性，采用基于聚乙二醇（PEG）的水化层以最大限度减少污损（非特异
摘要
血清中低丰度生物标志物的直接电化学检测需要同时兼顾灵敏度、抗污能力和生物相容性。本研究构建了一种分级结构生物传感界面AuNRs@PEG@PEDOT:Hep，该界面将垂直排列的金纳米棒阵列结合聚光效应以增强导电性，采用基于聚乙二醇（PEG）的水化层以最大限度减少污损（非特异性吸附降低92%），并引入肝素掺杂的聚（3,4-乙烯二氧噻吩）（PEDOT:Hep）基质以确保血液相容性，活化部分凝血活酶时间（APTT）超过43 s。该传感器功能化修饰了抗CD86和抗CD206抗体，实现了血清中巨噬细胞极化标志物的无标记检测，线性检测范围为1 pg/mL ~ 1 μg/mL，检测限为0.41–0.66 pg/mL（S/N = 3）。在小鼠炎症模型中的实时监测显示，M1与M2表型之间的动态转换与疾病进展密切相关。本研究为在复杂生物基质中进行高灵敏、高鲁棒性的即时检测提供了可扩展的界面设计方案。
引言
对天然生物流体中动态生物标志物转变的实时监测是精准医学的基本途径[1]、[2]，能够实现早期诊断、治疗指导以及对疾病发生机制的深入理解[3]、[4]、[5]。在众多医学检测中，巨噬细胞极化——即巨噬细胞在促炎（M1）表型与抗炎（M2）表型之间的功能可塑性转换——是免疫稳态和炎症性疾病进展的核心调节因素[6]、[7]。这种动态平衡影响着多种疾病的结局，包括类风湿性关节炎、动脉粥样硬化、脓毒症和癌症[8]、[9]。因此，监测这种表型转换——通常通过全身循环中CD86（对应M1）和CD206（对应M2）等表面标志物的表达来指示——为了解宿主的实时免疫和炎症状态提供了微创的洞察[10]、[11]。然而，这些蛋白生物标志物在血清中的直接定量分析仍然是一项挑战[12]。这主要是由于它们的超低浓度，通常低于10 pg/mL[13]。此外，血清基质的复杂性——其中含有自身的蛋白质、脂质和电解质污染——会污损传感界面并掩盖特异性信号[14]。
电化学生物传感器是一种有前景的平台，能够实现经济、快速且可微型化的即时诊断，具有高度灵敏性、固有特异性和与便携仪器兼容的特点[15]、[16]、[17]。这些系统通常将生物识别元件（如抗体）与转导界面相结合，后者将分子结合事件转化为可测量的电信号[18]。为了增强性能，金属纳米颗粒[19]、[20]、[21]、[22]已被广泛用于放大电化学响应并提高灵敏度。与此同时，利用亲水性聚合物和两性离子涂层等抗污剂进行表面修饰，已被用于抑制非特异性吸附并提高信号随时间的稳定性[23]、[24]、[25]。尽管这些策略改善了受控环境下的生物传感器性能，但它们往往仅解决了生物界面挑战的一至两个方面。因此，大多数现有系统仍然存在功能局限性[26]、[27]，无法在复杂未处理的介质（如外周血血清）中实现高灵敏、稳定且直接的检测。为了在这些苛刻条件下可靠运行，特别是在长时间暴露期间，传感界面必须同时满足三个关键但常常相互矛盾的要求：高灵敏度、强抗污能力和生物相容性。具体而言，(i) 高灵敏度需要导电界面以支持高效的电子转移实现信号放大[28]；(ii) 有效抗污需要能够最小化非特异性蛋白吸附的表面[29]，通常通过聚乙二醇（PEG）等绝缘或钝化层来实现[30]；(iii) 生物相容性，尤其是血液相容性，对于预防血栓事件[31]至关重要，如血小板黏附和纤维蛋白原沉积，这些事件可能损害与血液接触应用中传感器的功能和安全[32]。因此，将这三个特性整合到一个协同界面中仍然是设计下一代用于实际生物应用的电化学生物传感器的根本挑战。
传统的解决这一三难困境各个方面的方法往往适得其反，因为增强某一性质通常会削弱另一性质。导电聚合物如聚（3,4-乙烯二氧噻吩）（PEDOT）具有出色的导电性和生物相容性；然而，它们在富含蛋白质的环境中容易发生快速生物污损，导致信号随时间显著衰减[33]、[34]。即使进行肝素等生物活性分子的修饰以改善血液相容性，对于长时间血清暴露而言，其抗污能力仍不够充分[35]。金属纳米结构如金纳米棒（AuNRs）能够增强导电性并提供聚光信号放大[16]、[36]，但它们的高表面能促进非特异性蛋白吸附，加剧界面污损[37]。相反，PEG等抗污聚合物能够形成有效的水化屏障以抵抗蛋白吸附[38]，但它们会绝缘电极表面，从而削弱电子转移并降低灵敏度。这些材料的简单混合或分层组合往往会引入界面不兼容性，如接触不良或机械剥离，并且无法达到在复杂生物基质中所需要的协同性能。此外，尽管持续血液相容性对于在血液或血清中长期运行的传感器至关重要[39]、[40]，但在传感器设计中经常被忽视。因此，开发一种合理设计的界面，在单一平台上协同结合导电性、抗污能力和生物相容性，仍然是一项挑战。
在此，本研究构建了一种分级结构生物传感界面（AuNRs@PEG@PEDOT:Hep），采用空间限定的纳米构筑策略协同整合导电性、抗污能力和生物相容性。与先前报道的金纳米棒、导电聚合物或抗污生物传感界面不同——这些界面通常仅解决生物界面挑战的一个方面——本AuNRs@PEG@PEDOT:Hep界面在单一的空间限定分级架构中整合了三个相互矛盾的功能：(i) 垂直排列的金纳米棒阵列提供聚光增强的导电性和大的电化学活性面积；(ii) 分子优化的PEG水化层将非特异性吸附抑制92%，同时仍允许电子隧穿，因为导电的金纳米棒支架补偿了PEG的绝缘性质；(iii) 肝素作为PEDOT的掺杂反离子，将导电基质本身转化为抗凝血组分。此外，该界面能够在血清中直接电化学追踪循环的M1/M2表面标志物（CD86/CD206）并进行体内验证。此外，通过CD86和CD206抗体的功能化修饰，该平台实现了巨噬细胞极化动态的实时无标记监测，在细胞模型和小鼠炎症系统中均验证了其高灵敏度、宽线性范围和血清中的鲁棒稳定性。本工作为下一代能够在复杂生物基质中直接运行的电化学生物传感器提出了一种可扩展的界面设计范式。
分节摘要
化学品与试剂
所有化学试剂均未经进一步纯化直接使用。氯化金（III）三水合物（HAuCl?·3H?O，Au ≥ 48.0%）和硼氢化钠（NaBH?，≥ 98.0%）购自麦克林（中国上海）。十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，C??H??BrN，≥ 99.0%）和硝酸银（AgNO?，≥ 99.0%）也购自同一供应商。盐酸（HCl，37.0% w/w）和抗坏血酸（C?H?O?，≥ 99.0%）同样来源于麦克林。过硫酸铵（(NH?)?S?O?，98.0%）和
结果与讨论
生物传感界面通过对玻碳电极（GCE）进行逐层功能化构建而成，首先使用0.05 μm Al?O?浆料进行镜面抛光，然后在?0.95 V（vs. Ag/AgCl）下进行恒电位电沉积金纳米棒以实现聚光信号放大；随后自组装巯基终止的PEG水化层以赋予针对复杂血清基质的优异抗污性能，这是在真实样本中可靠检测生物标志物的关键创新。
结论
总之，血清中低丰度生物标志物的直接检测需要电化学界面同时提供高灵敏度、抗污能力和血液相容性，但这些要求在单一表面上的协调十分困难[12]、[14]。我们针对巨噬细胞极化——炎症性疾病的核心过程[6]、[7]、[58]——的实时监测构建了分级结构AuNRs@PEG@PEDOT:Hep界面来应对这一挑战：
CRediT作者贡献声明
Chen Dongliang：撰写初稿、可视化、验证、软件、方法论、调查、正式分析、数据整理、概念构思。Li Mengpeng：正式分析、数据整理、概念构思。Wang Xiangya：方法论、调查、概念构思。Wang Yumeng：软件、正式分析。Li Yang：方法论。Huang Shengnan：方法论。Zhang Tingting：软件。Yang Dawei：资源。Ran Fen：撰写——审阅与编辑、监督、项目管理，
利益冲突声明
作者声明不存在任何已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。
致谢
本研究部分得到国家自然科学基金（52463013）和甘肃省优秀博士学者培养计划（26JRRA556）的支持。
陈栋良|李猛鹏|王相亚|王玉萌|李阳|黄升南|张婷婷|杨大伟|冉芬
