6PPD-Q与人游离转铁蛋白的相互作用伴随肝脏铁代谢失调及促铁死亡反应：来自体外和斑马鱼研究的证据

《Journal of Hazardous Materials》：6PPD-Q Interaction With Human Apo-Transferrin Accompanies Hepatic Iron Dysregulation and Pro-Ferroptotic Responses: Evidence From In Vitro and Zebrafish Studies

　　

摘要

铁死亡作为细胞稳态的重要机制，依赖于去铁转铁蛋白（apo-TRF）介导的铁稳态。然而，新兴污染物如何通过干扰apo-TRF来破坏这一平衡仍不清楚。尽管已知高毒性的N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺醌（6PPD?Q）可诱发氧化应激和全身毒性，但其是否通过靶向apo?TRF触发铁死亡尚不明确。因此，本研究采用多光谱技术、分子模拟和体内斑马鱼暴露实验，探讨了6PPD?Q与apo?TRF之间的潜在相互作用机制。光谱结合分子对接表明形成了中等亲和力的复合物（K? = 1.6 × 10⁴ M^–1，298 K）。此外，该结合过程是自发的，由氢键（H-bonding）和范德华力驱动。α-螺旋含量的降低（从17.3%降至14.3%）表明apo-TRF的构象更加舒展，与分子动力学（MD）模拟结果一致。进一步地，分子对接表明与铁结合相关的氨基酸残基（Tyr426、Tyr517、Asp392和His585）参与了与6PPD?Q的相互作用。斑马鱼暴露实验显示转铁蛋白和铁死亡相关基因（如gpx4a, gpx4b, slc7a11, tfr1a, hamp等）表达异常，伴随肝脏中二价铁沉积和脂质过氧化升高。同时，6PPD-Q与Fe³⁺对apo-TRF的竞争结合分析表明，6PPD-Q与铁结合口袋相互作用并损害Fe³⁺的装载。本研究为apo?TRF-6PPD?Q相互作用提供了新的视角，揭示了相互作用驱动的apo-TRF结构改变影响其正常生理功能，从而破坏铁稳态并触发促铁死亡反应。

引言

铁死亡是一种铁依赖性的程序性细胞死亡形式，已成为环境毒理学和病理生理学中的关键机制[1]。与凋亡或坏死不同，它由铁催化的脂质过氧化和活性氧（ROS）的积累驱动[2]。越来越多的证据表明，这一过程在推动多种病理过程中起着关键作用，包括神经退行性变和继发性缺血再灌注急性组织损伤[3]、[4]。铁稳态的破坏是这一致死过程的核心，也是铁死亡的主要触发因素[5]。重要的是，环境污染物日益被认为是这种微妙铁平衡的有力外源性破坏者[1]。因此，阐明这些污染物干扰铁稳态的具体机制对于准确的毒理学风险评估至关重要。

作为轮胎橡胶添加剂N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺（6PPD）衍生的强毒性物质，N-(1,3-二甲基丁基)-N′-苯基-p-苯二胺醌（6PPD-Q）已成为全球环境和健康相关研究的重要课题[6]。在全球范围内，每年轮胎和道路磨损颗粒的排放量估计约为600万吨[7]。在此背景下，6PPD-Q可通过城市径流等途径广泛进入环境系统[8]。环境监测显示，中国珠三角地区水体中6PPD-Q的平均浓度据报道为1562 ng/L[9]。在西雅图的道路径流中，其浓度可高达19.0 μg/L[10]。这一水平远高于其对银大麻哈鱼的半致死浓度（LC₅₀ ≈ 0.79 μg/L），对水生生态系统构成严重威胁[6]。

更重要的是，6PPD-Q的毒性效应不仅局限于水生生物，还已在哺乳动物和人类中有所报告[11]。近期研究表明，该化合物表现出明显的神经毒性和生殖毒性，并可在多个生物系统中诱发氧化应激并破坏脂质代谢[11]、[12]。尽管6PPD-Q是6PPD的氧化转化产物，但越来越多的证据表明，这两种化合物表现出不同的毒理学特征和组织特异性反应，凸显了将6PPD-Q作为独立毒理学实体进行研究的必要性[13]。此外，Liu等人的研究表明6PPD-Q可能诱导铁死亡相关过程[14]。人体研究显示，6PPD-Q可穿越血脑屏障并在脑脊液中检测到，表明其能够进入关键组织[15]。Yi等人近期发表的一篇全面综述总结了这些普遍的各系统毒性和全球生态健康风险，明确指出与6PPD-Q积累相关的神经毒危害[13]。此外，接触6PPD-Q与儿童体质指数降低和流感发病率增加有关[16]。这些发现突显了6PPD-Q对人体健康的潜在风险，揭示其具体毒理学效应已成为一项迫切任务。

转铁蛋白，特别是其无铁形式（apo-TRF），在维持全身铁稳态中发挥着核心作用[17]。作为主要的细胞外铁转运蛋白，转铁蛋白通过多种机制调节细胞内铁平衡：维持Fe³⁺的生理溶解度、将铁稳定在氧化还原惰性状态以防止氧化损伤，以及螯合游离铁以限制病原体的生长[18]。这一精密控制的功能由转铁蛋白独特的双叶结构介导，其中每个叶包含一个高亲和力铁结合位点，能够实现apo-TRF和铁装载的holo-TRF之间的动态转换[19]、[20]。在生理条件下，循环转铁蛋白中约70–80%以apo-形式存在，为铁的波动提供了强大的缓冲能力。当这种缓冲能力受损时，有毒的非转铁蛋白结合铁（NTBI）会积聚。这可能是由于铁过载时转铁蛋白饱和或其功能受损所致，最终导致铁死亡性细胞死亡[18]、[21]。在此背景下，识别干扰apo-TRF功能的因素具有重要意义。

除了其在铁缓冲中的作用外，apo-TRF还具有特征明确的受体介导转运能力。因此，它已被广泛用作肿瘤等疾病靶向药物递送系统中重要的蛋白载体[22]。然而，这种转运特性也表明apo-TRF可能与外源性小分子相互作用，包括环境污染物。它也可能介导这些物质在体内的分布和转运。此类蛋白-配体相互作用可能会损害apo-TRF的构象稳定性。因此，其内源生物学功能可能受损，尤其是其铁结合和转运能力[23]。相应地，apo-TRF的结构和功能完整性对于维持铁稳态和防止铁介导的毒性至关重要。更广泛地说，这些发现提出了环境污染物可能通过干扰铁代谢中关键蛋白质来发挥毒性效应的可能性。鉴于铁失衡与6PPD-Q诱导的毒性之间密切相关，假设为6PPD-Q可能破坏apo-TRF的正常生理功能。这种破坏可能促进Fe³⁺向Fe²⁺的异常还原，并最终触发铁死亡。

本研究在模拟生理条件下体外探讨了6PPD-Q对转铁蛋白结构和功能的影响。随后，通过体内动物实验评估了6PPD-Q暴露对转铁蛋白相关基因表达和铁沉积的影响。本研究旨在检验以下假设：6PPD-Q与apo-TRF之间的相互作用导致apo-TRF功能障碍、铁稳态紊乱和铁死亡相关反应。这些发现有望阐明转铁蛋白在6PPD-Q诱导毒性中的潜在作用，并提供相关通路的机制性见解。

部分摘要

材料

6PPD-Q（CAS号：2754428-18-5）购自LGC Labor GmbH（Bgm. -Schlosser-Str. 6 A, 86199 Augsburg, 德国），apo-TRF（apo-Transferrin human, CAS号：11096-37-0）购自Sigma-Aldrich Chemical Company（美国圣路易斯）。分别使用超纯水和甲醇配制浓度10^–3 M的apo-TRF和6PPD-Q母液。Tris-HCl缓冲液（pH 7.4）于?4°C冷藏，母液于?80℃冷冻保存备用。所有试剂

相互作用研究

内源性荧光信号主要来源于蛋白质中的色氨酸（Trp）、酪氨酸（Tyr）和苯丙氨酸（Phe）残基，这些残基对配体存在和蛋白质构象变化都具有极高的敏感性[24]。因此，荧光滴定法被广泛用于研究配体-蛋白相互作用。如图1 A所示，在298 K条件下，apo-TRF在所有实验条件下均表现出一致的330 nm最大荧光发射，包括两者

结论

本研究利用体内和体外实验探讨了6PPD?Q与apo?TRF之间的相互作用及其对铁稳态的潜在影响。光谱分析与分子对接表明6PPD?Q与apo?TRF形成中等亲和力的复合物。该结合过程是自发的，主要由氢键和范德华力驱动。三维荧光光谱显示斯托克斯红移，圆二色谱显示α?螺旋含量降低，表明

环境意义

6PPD-Q作为一种有毒的轮胎磨损副产物，可能通过粉尘、食物和水暴露对人体健康构成新兴风险。我们证明，6PPD-Q结合会在体外诱导apo-TRF的构象改变和功能损害。这些分子层面的发现得到了体内斑马鱼实验的补充，实验显示肝脏转铁蛋白和铁死亡相关基因表达失调，伴随铁沉积异常和脂质过氧化。总体而言，这些发现

CRediT作者贡献声明

Chi Baozhu（池宝柱）： 撰写 – 审阅与编辑，监督，资金获取，数据整理。Li Mengqi（李梦琪）： 验证，数据整理。Lin Xiner（林馨儿）： 软件，数据整理。Li Yixuan（李一璇）： 撰写 – 审阅与编辑，可视化，资源，形式分析。Shi Jingfei（石景飞）： 撰写 – 审阅与编辑，可视化，软件，方法论。Li Xiting（李希婷）： 撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 初稿，软件，方法论，调查，数据整理。Zhao Sujuan（赵素娟）： 撰写 – 审阅与编辑，撰写 –

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性财务利益或可能影响本文所报道工作的个人关系。

致谢

本研究受国家自然科学基金（编号：32460306和22064012）、江西省自然科学基金（编号：20242BAB25202）和安徽省教育厅科研基金（2025AHGXZK31179）资助。

李希婷|李一璇|石景飞|李梦琪|林馨儿|池宝柱|赵素娟|托勋

南昌大学化学与化学工程学院，中国江西南昌 330031