基于与人相关的肺模型的氧化铈与硫酸钡纳米颗粒机制性危害鉴别

《Journal of Hazardous Materials》：Mechanistic hazard differentiation of Cerium Oxide and Barium Sulfate Nanoparticles using a Human-Relevant Lung Model

　　

## 摘要

减少动物实验的监管压力日益增大，加速了危害评估中"新方法学"（NAMs）的发展。本研究采用Calu-3/单核细胞来源巨噬细胞（MDMs）气-液界面共培养模型，评估了氧化铈（CeO?）和硫酸钡（BaSO?）两种职业相关性纳米颗粒的生物效应。BaSO?的剂量范围为6至324 μg/cm2，CeO?的剂量范围为9至324 μg/cm2，样本在第1、3和7天进行分析。将上皮屏障完整性、细胞毒性、炎症细胞因子分泌以及靶向转录反应等指标映射至炎症诱导肺纤维化有害结局路径（AOP173），并与已发表的啮齿类动物吸入及人体数据进行了比较。CeO?诱导了持续的基底侧IL-8分泌，伴随NF-κB激活以及氧化应激、DNA损伤和蛋白毒性应激标志物的上调，在第3天中等剂量（108 μg/cm2）时达到峰值。上皮屏障完整性保持完好，而分子终点检测到早期与AOP相关的应激反应。BaSO?在所有终点上仅引起轻微反应，与体内及人体数据一致，被正确鉴定为低危害材料。通过将多终点反应整合至AOP框架中，本研究证明基于人类细胞的共培养模型能够在机制上区分具有不同危害特征的纳米颗粒。

## 引言

纳米颗粒（NPs）在工业、商业和消费品中的应用日益广泛，引发了对职业和环境暴露的担忧，尤其是通过吸入途径——这是空气颗粒物主要的摄入途径[1]。在这些材料中，氧化铈（CeO?）和硫酸钡（BaSO?）代表了两种产量巨大、物理化学和毒理学特征截然不同的纳米颗粒，是危害评估的有价值的参考材料。

CeO?纳米颗粒被用作柴油燃料添加剂以提高燃烧效率并减少烟尘排放，也被用作半导体和光学行业的抛光剂，以及固体氧化物燃料电池中的电解质材料[2]。其燃烧相关用途导致CeO?纳米颗粒直接释放到周围环境中，增加了城市和职业环境中的空气纳米颗粒负荷，引起了公众和劳动人群对吸入暴露的担忧。CeO?在肺部具有生物持续性，在啮齿类动物亚慢性暴露研究中观察到清除受损和蓄积[3]，其蓄积与职业暴露工人（包括光学透镜研磨工和照相制版工）中出现的稀土类尘肺病相关[4]、[5]、[6]。值得注意的是，美国职业安全与健康管理局（OSHA）尚未为CeO?建立纳米特异性职业接触限值；目前它被归类于"其他未规定颗粒物"（PNOR）的一般类别，可吸入部分的 permissible exposure limit（PEL）为5 mg/m3[7]。这一监管空白，结合CeO?肺毒性的日益增长的证据以及作为燃烧副产物释放到环境中的事实，凸显了从与人相关的检测系统中获取机制性危害数据的必要性。

相比之下，BaSO?广泛用于涂料、涂层和塑料中，并在医学成像中用作不透X线造影剂。它通常被认为毒性较低，OSHA将其与可溶性钡化合物分开分类，并赋予相对较低的PEL，总计10 mg/m3，可吸入部分为5 mg/m3[7]。在职业环境中，长期吸入BaSO?粉尘可引起钡肺病，这是一种良性的、非纤维化性的尘肺病，其特征是X线片上出现明显的密度增高影，肺功能不受损害或无症状，暴露停止后逐渐恢复[8]、[9]。

除了用途和监管状态的不同之外，CeO?和BaSO?的肺部行为差异还归因于它们在生物体液中的溶解行为不同。在模拟溶酶体条件下，连续流动溶解研究将BaSO?归类为部分溶解性材料，其离子释放受局部离子饱和度而非颗粒尺寸的控制，预测的溶解半衰期（约11天）与其体内肺部清除半衰期（9.6天）紧密匹配[10]。相比之下，CeO?的溶解程度较小，这与上述的长期滞留和蓄积潜力一致[3]。这种差异已在细胞水平上被直接观察到：在人类肺泡上皮单培养模型中，两种纳米颗粒均主要保留在顶侧室，基底侧转位极少，但在24至80小时之间，BaSO?的细胞内比例明显下降得更快，这一差异归因于BaSO?在模拟溶酶体条件下较高的溶解速率[11]。这些发现表明，两种纳米颗粒在内部化后遵循不同的机制，这进一步印证了它们危害特征的差异。

CeO?和BaSO?危害特征的差异还通过一系列体内吸入研究得以确立。在一项针对14种纳米颗粒的全面短期吸入筛选中，基于支气管肺泡灌洗参数和组织病理学评估，CeO?排名在毒性效力较高的材料之列，而BaSO?排名在毒性最低的材料之列[12]。此外，这两种材料均被选为欧洲NANoREG项目和经合组织（OECD）纳米材料测试赞助框架内的代表性纳米颗粒，并在欧盟Horizon 2020 PATROLS项目中进行了进一步评估，该项目开发了工程纳米材料体外暴露的合理给药指导方针[13]。

尽管已有广泛的体内表征，但将这些发现转化为使用与人相关的体外模型进行机制性理解仍然具有挑战性。包括单培养、共培养和高级三维气道组织在内的一系列体外模型已被使用。一项研究表明，大鼠肺泡巨噬细胞可以区分生物学活性纳米颗粒与惰性纳米颗粒，包括CeO?和BaSO?，与短期体内数据有良好的相关性，但这种方法仅依赖单一细胞类型，因此其适用性仅限于可被吞噬且分散良好的材料，仅捕获巨噬细胞介导的机制，而未考虑上皮细胞的直接效应、上皮-免疫细胞间的交叉对话或屏障功能[14]。此外，在不同研究中，纳米颗粒在淹没式、气-液界面（ALI）或伪ALI（有时称为准ALI）条件下施加[11]、[15]。值得注意的是，ALI暴露始终表现出比传统淹没式方法更高的敏感性和与体内结果的更好一致性[16]、[17]、[18]。伪ALI暴露介于ALI（即气溶胶暴露）和淹没培养水平之间。该方法技术上易于操作，且在不同实验室之间更容易重复；因此，被广泛使用。已有研究表明，该方法产生的生物学反应与基于气溶胶的ALI递送所获得的相当[19]、[20]，支持了在无需专用设备即可在生理相关条件下评估纳米颗粒危害的有效性。

有害结局路径（AOP）概念为解读机制性体外数据提供了结构化的框架[21]，即一系列因果关系相连的生物事件，将分子起始事件与对监管决策具有相关性的有害结局联系起来。将体外终点映射至AOP关键事件，可以使危害测试从描述性终点向基于体内相关性的机制性解读迈进。然而在实践中，体外研究在模型复杂度、暴露条件和生物学终点数量及类型方面存在差异，从而限制了跨研究和机制性解读。尽管高级模型通过纳入多种细胞类型、极化的上皮结构和生理相关的暴露具有明显优势，但其多终点反应很少被映射至AOP，特别是对于CeO?和BaSO?这类材料，因为相关的吸入AOP仍处于主要开发阶段，关键事件之间的关系多为定性描述，因此这些读出通常被报告为危害特征，而非作为因果路径中的关键事件[21]。

AOP框架作为监管决策工具已获得日益增长的关注。基于AOP的皮肤致敏性体外测试指南的成功监管采用，包括OECD测试指南442 C、442D和442E，这些指南整合在OECD TG 497的限定方法（defined approaches）框架中，展示了AOP框架在替代动物实验方面的实际转化潜力[22]、[23]、[24]、[25]，目前针对吸入毒性终点的类似工作也在进行中[26]。AOP173描述了从物质与肺驻留细胞膜相互作用到炎症诱导肺纤维化的路径，为将体外终点映射至因果关系相连的关键事件以及评估给定检测系统是否捕获了相关生物学过程提供了结构化框架[27]。

在本研究中，我们使用了一种由Calu-3细胞（支气管上皮细胞系）和单核细胞来源巨噬细胞（MDMs）组成的人类共培养模型，在气-液界面进行培养，以评估不同剂量范围内CeO?和BaSO?纳米颗粒的生物效应。该模型最初是为气-液界面的长期重复气溶胶暴露而优化的[28]，随后在欧盟Horizon 2020 PATROLS项目中被证明可在七个独立实验室之间转移和重复[29]。最近，暴露方案和终点选择进一步得到了完善，并以晶体二氧化硅（DQ12）作为参考颗粒与体内结果进行了直接比对，证明了该模型捕获具有生物学意义的时间分辨炎症反应的能力[30]。在此已建立的模型基础上，我们评估了颗粒在细胞培养基中的物理化学行为、上皮屏障完整性、细胞毒性、炎症细胞因子分泌以及跨氧化应激、炎症、DNA损伤和凋亡通路的靶向基因表达。通过将这些终点映射至AOP173的关键事件并与已发表的体内数据进行比较，我们旨在确定能否使用这种与人相关的体外模型在机制上区分CeO?和BaSO?，并识别连接其不同物理化学行为与炎症诱导肺纤维化的早期关键事件。这些发现有助于对吸入纳米颗粒危害进行更机制化、更材料特异性的表征，同时也支持了减少动物模型依赖的替代测试策略的发展。

## 化学试剂

所有化学试剂均购自Sigma-Aldrich（瑞士），除非另有说明，所有细胞培养试剂均购自Thermo Fisher Scientific（瑞士）。

## 测试纳米颗粒

氧化铈（CeO?）NM-212和硫酸钡（BaSO?）NM-220纳米颗粒（NPs）购自Fraunhofer IME，并在经合组织（OECD）制造纳米材料测试工作组方案[31]中作为选定的代表性材料使用。所使用材料的完整物理化学表征数据

## 颗粒表征

为研究纳米颗粒的形貌和尺寸，采用了透射电子显微镜（TEM）。氧化铈（CeO?）纳米颗粒呈棱角分明和面状，显示不规则的多面体形貌（图1A）。相比之下，硫酸钡（BaSO?）纳米颗粒呈现更圆润的形貌（图1B）。对于两种材料，在Milli-Q水中的TEM成像显示由不规则颗粒组成的聚集体。CeO?纳米颗粒为多分散的，等效圆直径（ECD）为20.06 ± 10.84

## 讨论

吸入氧化铈（CeO?）和硫酸钡（BaSO?）等纳米颗粒是一个日益增长的职业健康关注问题，然而来自与人相关的检测系统的机制性危害数据仍然有限。在本研究中，我们采用了Calu-3/MDMs共培养模型，以评估在锚定于体内暴露的剂量范围内，能否在体外捕获材料特异性的生物学反应。

## 结论

本研究证明，在伪ALI条件下暴露的Calu-3/MDMs共培养模型，在锚定于体内暴露的宽剂量范围内，能够机制性地区分具有根本不同危害特征的纳米颗粒，并捕获炎症诱导肺纤维化AOP173中的早期关键事件。CeO?产生了协调的、短暂的NF-κB介导的炎症反应，最显著地表现为显著的、持续的基底侧IL-8分泌，伴随……

## CRediT作者贡献声明

Jorge Larios：可视化、形式化分析。Sandor Balog：撰写–审阅与编辑、调查、数据整理。Martina Dzepic：撰写–审阅与编辑。Alke Petri-Fink：撰写–审阅与编辑、指导。Fabian Blank：撰写–审阅与编辑、资金获取、概念化。Barbara Rothen-Rutishauser：撰写–审阅与编辑、指导、资源、资金获取、概念化。Loncarevic Isidora：撰写–原稿、可视化、方法论。

## 利益冲突声明

作者声明他们不存在可能影响本文所报告工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

## 致谢

本研究由瑞士国家科学基金会NRP 79项目（编号407940_206331 / 1）和Adolphe Merkle基金会支持。

## 意义声明

JHM必需：环境影响声明（100字，另行提交）：

氧化铈和硫酸钡纳米颗粒通过工业用途释放到环境中：CeO?作为柴油燃料添加剂的燃烧副产物，BaSO?作为涂料和涂层中的填料以及油气钻井液中的加重剂，

Isidora Lon?arevi? | Seyran Mutlu | Roman Mmanda Fortunatus | Nathalie Jung | Jorge Larios | Sandor Balog | Martina Dzepic | Alke Petri-Fink | Fabian Blank | Barbara Rothen-Rutishauser

阿道夫·默克尔研究所，弗里堡大学，Chemin des Verdiers 4, 1700 Fribourg, 瑞士