人脑脊液中狂犬病毒糖蛋白抗体间接ELISA检测方法的建立及其诊断评估

《Journal of Immunological Methods》：Development and diagnostic evaluation of indirect ELISA for detecting antibodies against the rabies virus glycoprotein in human cerebrospinal fluid

　　

凝集素纯化的RABV糖蛋白被用作间接ELISA的抗原。间接ELISA可检测脑脊液中的IgM、IgG及多价抗RABV G抗体。检测方法表现出优良的分析性能，变异性和基质效应低。多价ELISA检测在狂犬病生前诊断中达到了最高诊断准确性（AUC 0.97，敏感性88.6%）。ELISA可检测脑脊液抗体，但这些抗体不具有相应的中和活性。

引言

狂犬病是一种急性、进行性且几乎 invariably 致命的病毒性脑脊髓炎，每年在全球150多个国家和地区造成约59,000人死亡（Schnell等，2010；WHO，2018）。这是一种人畜共患疾病，可影响哺乳动物的中枢神经系统（CNS），包括人类。一旦症状出现，病死率几乎达到100%。尽管已有有效的疫苗可用，狂犬病仍然是重大公共卫生问题，特别是在医疗和动物防控资源有限的地区（Fooks等，2014）。

狂犬病的病原体是狂犬病毒（RABV），一种嗜神经病毒，属于弹状病毒科（Rhabdoviridae）、水疱病毒属（Lyssavirus），种名为狂犬病毒（Wunner，1998；ICTV，2025）。RABV是一种有包膜、不分节段、单链、负链RNA病毒，基因组约12 kb，编码五种结构蛋白：核蛋白（N）、磷蛋白（P）、RNA依赖的RNA聚合酶（L）、基质蛋白（M）和糖蛋白（Sokol等，1971；Batista等，2007；Katz等，2017）。

在这些蛋白中，狂犬病毒糖蛋白（RABV G）具有重要的生物学和免疫学意义。它是一种I型跨膜蛋白，具有高度免疫原性，也是唯一暴露在病毒表面的蛋白。G蛋白介导病毒进入的关键步骤，包括受体结合以及病毒包膜与内体膜的融合，并对病毒致病性有贡献（Gaudin等，1993；Tuffereau等，1998；Takayama-Ito等，2006）。此外，它还诱导体液免疫和细胞免疫反应，这些反应对保护至关重要（Benmansour等，1991；Gupta等，2005；Cox等，1977；Macfarlan等，1986），使其成为疫苗开发的关键靶点（Ertl，2019）。

RABV G是一种高度糖基化的包膜蛋白，分子量约65 kDa，由三个结构域组成：胞外域（氨基酸1–439）、跨膜域（440–461）和胞内域（462–505）（Wunner，1988）。该蛋白可采取多种构象，直接影响其抗原性和免疫识别（Maillard和Gaudin，2002）。

糖基化对于正确折叠、生物学功能、免疫原性和疫苗效力至关重要（Burger等，1991；Shakin-Eshleman等，1992；Yelverton等，1983）。对RABV糖蛋白糖链的化学分析表明，甘露糖、半乳糖、N-乙酰葡糖胺和唾液酸是主要的寡糖成分，而岩藻糖含量较少（Dietzschold，1977）。正确的折叠和糖基化对于产生被体液免疫和细胞免疫反应识别的构象表位至关重要（Szabó等，2009；Kieny等，1984；Yelverton等，1983）。由于其高度免疫原性和诱导中和抗体的能力，G蛋白已被广泛用于多种具有公共卫生重要性的病毒疾病的免疫诊断检测，包括登革热、肝炎、风疹和HIV（Banerjee和Mukhopadhyay，2016）。

鉴别狂犬病与其他病毒性脑炎需要在多种样本类型上进行针对性检测（Stein等，2010）。确诊生前诊断建议分析脑脊液（CSF）、唾液、血清和后颈部皮肤活检。直接检测方法——如病毒抗原的免疫荧光检测——以及分子技术如RT-PCR和使用快速荧光焦点抑制试验（RFFIT）评估病毒中和抗体的血清学检测——共同提高诊断敏感性，并允许早期识别感染。国际卫生组织强调，在所有疑似病例中应迅速启动诊断调查，以指导治疗决策并确保恰当地实施暴露后预防（PEP）措施（WHO，2018）。

尽管技术进步，人类狂犬病的生前诊断仍然具有挑战性。虽然阳性和经验证的实验室结果可以确认感染，但阴性结果并不一定排除疾病，这凸显了当前生前检测方法的一个关键局限性（WHO，2018）。因此，建议使用连续临床样本结合多种诊断方法来提高诊断敏感性（Crepin等，1988；Dacheux等，2010；Mani等，2016）。

检测血清或脑脊液中的病毒特异性抗体具有有限的诊断价值，因为血清转换通常发生在病程晚期（Schuller等，1979），且大多数患者在症状出现后几天内死亡。然而，在未经疫苗接种者的血清中，或在已接种及未接种患者的脑脊液中检测到病毒特异性抗体，均可为诊断提供支持，尤其是在存活时间较长的病例中。

世界卫生组织（WHO）推荐的病毒中和抗体检测金标准血清学方法为RFFIT（Damodar等，2019；WHO，2018）。尽管中和试验应用广泛，但其标准化困难，需要较长的孵育时间（通常超过24–48小时），并且依赖活病毒和允许性细胞系，这要求在具备良好装备的生物安全二级（BSL-2）实验室中进行安全操作（Ashwini等，2024；Ciconello等，2022；Divase等，2024）。此外，酶联免疫吸附测定（ELISA）也可用于人类生前抗体检测，适用于血清和脑脊液样本，正如WHO所建议（WHO，2018）。基于ELISA的检测方法用于确定疫苗接种后的抗体反应时，主要使用RABV G作为靶抗原。

ELISA，尤其是间接法格式，因其高敏感性、特异性和可扩展性而被广泛用于抗体检测（Lequin，2005）。在病因不明的脑炎病例中，早期检测狂犬病特异性抗体对于临床诊断和患者管理可能至关重要。由于脑脊液直接与中枢神经系统相关，在脑脊液中检测到狂犬病特异性抗体可能反映鞘内免疫反应，并为狂犬病感染提供诊断证据。脑脊液中抗体的检测被认为是狂犬病病毒感染的指标，无论其疫苗接种史如何，这支持了基于抗体的检测方法在脑脊液样本中的诊断价值（Damodar等，2019；CDC，2026；De Pijper等，2025；Mani等，2016）。

虽然基于ELISA的方法检测血清中狂犬病抗体已经确立（Cliquet等，1998；Lugelo等，2023；Muhamuda等，2006），但大多数应用集中在对人类和动物疫苗接种后中和抗体的定量上。在脑脊液中检测病毒特异性IgG和IgM抗体代表了一种有前景的补充方法，可用于识别病毒暴露并支持生前诊断（WHO，2018）。虽然IgG通常表明既往接触过RABV抗原，而IgM在最近感染的急性期先于IgG出现。然而，仅有少数研究评估了脑脊液中的ELISA检测方法，现有证据仍然稀少（Damodar等，2019；Realegeno等，2018），凸显了一个相关的方法学空白和进一步研究的需要。

本研究描述了开发一种间接ELISA检测方法，用于检测脑脊液样本中针对经Lens culinaris凝集素亲和层析纯化的天然RABV G的IgM、IgG及多价免疫球蛋白（A、M、G）。因此，建立靶向脑脊液的ELISA检测方法代表了一种有前景且相对未充分探索的诊断途径。该方法旨在为狂犬病生前诊断提供一种可靠、低成本且广泛适用的工具。

**人体脑脊液样本**

本研究共纳入92例人体脑脊液样本，这些样本于2011年至2025年间提交至巴西圣保罗巴斯德研究所诊断部门，用于疑似狂犬病病例的生前调查。这些样本仅根据实验室标准被归类为狂犬病阳性或狂犬病阴性，包括RT-PCR、组织培养感染试验（RTCIT）、小鼠接种试验（MIT）和RFFIT。RT-PCR阳性样本经以下方式确认……

**样本稳定性**

由于存档的脑脊液样本收集时间跨度较长（2011–2025年），所有标本在进行ELISA分析前均通过RFFIT进行了重新检测。重复的RFFIT试验显示，在定性分类上与GAL系统记录的原始结果具有100%的一致性，所有14例初始阳性和78例初始阴性样本均保持原始分类。定量狂犬病病毒中和抗体滴度在原始RFFIT和重复RFFIT之间存在差异……

**讨论**

在本研究中，我们开发并进行了分析验证，使用经Lens culinaris凝集素亲和层析纯化的RABV G为抗原，对脑脊液中针对RABV G的IgM、IgG及多价免疫球蛋白（A、M、G）进行间接ELISA检测。采用综合实验室诊断框架对疑似人类狂犬病病例的脑脊液样本进行分类，并使用RFFIT评估ELISA反应性样本中的病毒中和活性。

**CRediT作者贡献声明**

Helena Ya Luen Wong：撰写—原稿、调查、形式化分析。Elaine Raniero Fernandes：撰写—审阅与编辑。Fernanda Guedes：撰写—审阅与编辑。Sandriana Ramos Silva：撰写—审阅与编辑、监督、资源、项目管理、方法论、资金获取、概念化。

**伦理批准**

本研究经巴西圣保罗市卫生部门研究委员会批准（批准编号：7.681.865）。

**作者贡献**

Helena Ya Luen Wong：执行实验、收集和分析数据、制作图表并参与稿件撰写；Elaine Raniero Fernandes：参与稿件的批判性修订；Fernanda Guedes：参与稿件的批判性修订；Sandriana Ramos Silva：构思和设计研究、监督项目、起草稿件、进行统计分析并参与稿件撰写。所有作者均已阅读并批准最终稿件。

**资金支持**

本研究由巴西圣保罗巴斯德研究所支持，项目编号：IP 41/25。

**未引用参考文献**

Bollag和Edelstein，1998；Burger，1991；Crepin等，1998；ICH—国际人用药品注册技术协调会，2022；ICTV—国际病毒分类委员会，2023；Koike等，2021；Moore等，2016；Szabó等，2009。

**利益冲突声明**

作者声明不存在利益冲突。

**致谢**

我们感谢巴西圣保罗巴斯德研究所提供的财政支持。

本手稿基于Helena Ya Luen Wong在Sandriana Ramos Silva博士指导下的学位论文工作数据集撰写而成。

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