《Journal of Immunological Methods》：A novel multiplex serological immunoassay for health monitoring in rodents
编辑推荐：
MIRIAD?测定能够以低成本格式同时检测针对多种病原体的抗体。与相应的商业单一酶联免疫吸附测定（ELISA）的符合率在94%至100%之间。MIRIAD?测定方案所需的血清量低于标准商业单一测定。采血过程创伤更小、疼痛更少。符合3Rs原则。
MIRIAD?测定能够以低成本格式同时检测针对多种病原体的抗体。与相应的商业单一酶联免疫吸附测定（ELISA）的符合率在94%至100%之间。MIRIAD?测定方案所需的血清量低于标准商业单一测定。采血过程创伤更小、疼痛更少。符合3Rs原则。
论文解读
在实验动物科学领域，维持无特定病原体（SPF）或特定及机会性病原体自由（SOPF）状态对于保障动物福利、降低人畜共患病风险以及保证生物医学研究的可重复性至关重要。未检出的病原体会引入显著的生物学变异，破坏数据完整性。基于FELASA建议的常规健康监测通常包括血清学、分子诊断（PCR/RT-PCR）、微生物培养和显微镜检查。尽管环境PCR（ePCR）和排气空气粉尘（EAD）采样等新技术提供了非侵入性替代方案，但血清学检测对于发现持续性或低排毒病原体（如细小病毒）以及排除因高灵敏度PCR产生的假阳性仍不可替代。传统商业血清学平台如微球多重检测（如MFIA?）尽管通量高，但需要昂贵仪器和专业操作，导致许多机构选择外包。外包带来时间延迟、排程限制以及对数据处理和诊断流程的掌控减弱，不利于暴发疫情的及时应对和群体管理的动态调整。因此，开发成本效益高、灵活且可在机构内部实施的多重检测方法，成为提升健康监测能力的关键方向。
研究人员开展了一项针对新型多重酶联免疫吸附样测定（ELISA-like assay）的评估研究，旨在检验其作为啮齿动物现场血清学监测工具的可行性。该研究测试了MIRIAD?多重测定（由GD Biotech制造）与商业单一靶标ELISA（Charles River及Biotech Trading Partners产品）的性能一致性，并验证该测定与血清运输卡的兼容性。研究在意大利国家研究委员会（CNR）设施进行，使用了来自68只小鼠和27只大鼠的血清样本。结果显示，MIRIAD?测定能够同时检测多种病原体特异性IgG抗体，且与商业单一ELISA的比较中，总体特异性接近100%，敏感性因靶标而异。研究还发现，该测定所需血清体积低至每孔2 μL，或约15 μL干血即可检测多达26种病原体，显著低于传统单一ELISA约每靶标10 μL的需求。因此，该平台支持更温和的采血方式，如面部静脉或眶后静脉丛采血，减少动物应激与痛苦，充分体现了3Rs原则。该论文发表于《Journal of Immunological Methods》。
为评估MIRIAD?测定性能，研究人员采用了以下主要技术方法：首先，使用MIRIAD?年度版（26种病原体抗原）或季度版（14种病原体抗原）试剂盒，通过抗原阵列同时捕获血清中特异性IgG；采用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗和TMB底物产生不溶性蓝色沉淀，利用MIRIAD?读取仪进行底部成像量化斑点强度，并以任意单位（A.U.）表示净斑点强度。其次，以商业单一靶标ELISA试剂盒为参考标准，进行平行检测以计算敏感性、特异性和符合率。第三，为验证干燥样本兼容性，将15只小鼠和3只大鼠的血清（各15 μL全血）滴加至血清运输卡（Innovative Diagnostics），干燥后于4 ℃保存5天以模拟运输条件，再按说明书洗脱，以1:50稀释度与新鲜血清（1:100稀释）平行检测。统计方法包括Pearson和Spearman秩相关分析，用于评估定量结果的相关性；诊断性能指标通过以相应商业ELISA为参考标准独立计算。所有样本均来自CNR设施（Monterotondo Scalo, Italy）。
研究结果方面，感染率分析显示，所有27份大鼠样本对所有血清学靶标均为阴性。68份小鼠样本中有37份（54%）鼠诺如病毒（MNV）抗体阳性；鼠肝炎病毒（MHV）阳性率为10%（7/68）；鼠细小病毒（MPV）阳性率为15%（10/68）；泰勒小鼠脑脊髓炎病毒（TMEV）阳性率为9%（6/68）；在年度版试剂盒检测的22份样本中，有1份（5%）检出毛螺杆菌（Clostridium piliforme）抗体。多病原体共阳性情况存在，其中5份样本同时为MNV、MHV、TMEV和MPV阳性。这些结果与历史流行病学数据相符，即MNV是实验室小鼠中最常见的病原体，但本研究中的血清阳性率（54%）高于早年欧洲调查的24%，反映了所选设施过去的疾病负担。
与商业ELISA的一致性比较显示，MIRIAD?与Charles River ELISA的符合率在多数靶标上为94%至100%。对于MNV，敏感性为95%（35/37真阳性及1份临界值），特异性为94%；MHV敏感性为64%（7/11真阳性及2份临界值），特异性为100%；MPV敏感性和特异性均为100%；TMEV敏感性为86%（6/7真阳性及1份临界值），特异性为100%。几乎所有靶标的特异性均为100%，仅MNV为94%。少数差异可能源于抗原表位暴露差异以及cut-off判定标准不同，临界值样本可能被商业试剂盒判为阳性而多重测定判为可疑。
定量相关性分析方面，将MIRIAD净信号强度（A.U.）与Charles River ELISA归一化净吸光度值进行比较。Spearman秩相关系数较低（MNV ρ=0.74，MHV ρ=0.415，MPV ρ=0.37，TMEV ρ=0.25，均p<0.05），这可能是大量阴性样本集中于检测限附近导致并列秩次，且高抗体水平下的ELISA饱和效应改变了样本排序。相比之下，Pearson相关系数显示出较强线性关系（MNV r=0.81，MHV r=0.75，MPV r=0.92，TMEV r=0.78，均p<0.05），提示两种检测格式的定量结果具有良好相关性。
干燥血清样本评估方面，新鲜血清与运输卡洗脱物的检测结果高度一致。MNV在两种格式中均为5份阳性；MHV新鲜血清有3份阳性，另有一份临界值在运输卡洗脱物（较低稀释度）中达到阳性阈值。Pearson相关系数MNV为r=0.99，MHV为r=0.87（p<0.05），证实了极佳的一致性和干燥样本兼容性。
讨论部分指出，MIRIAD?测定的多重设计允许同时快速筛查多种病原体，临界结果可选择性复测确认。结合易用性、低样本量需求和多靶标能力，该平台非常适合在实验动物设施中常规部署。该测定显著支持3Rs原则，通过极低的采血量需求（每孔2 μL血清或约15 μL干血）减少侵入性操作，从而降低动物不适。
研究结论为：这项初步研究证明了多重ELISA样测定可作为啮齿动物群体多种传染病原体同时筛查的有效工具，与传统单一靶标ELISA具有强符合率，并兼容干燥血清形式。其操作简便、样本需求少、多靶标检测能力，使其适用于实验动物设施的常规监测。未来纳入更多商业单一和多重MFIA参考测定，并在更大规模和高阳性率队列中开展评估，将进一步完善该测定的诊断覆盖范围、稳健性和实用性。
