《Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology》：When light colour matters: Spectral quality is associated with distinct small RNA candidates in
Arabidopsis thaliana
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摘要入射光的光谱组成可被植物光受体感知，并能够快速重塑下游基因表达程序；然而，除已注释的miRNA外，其对小RNA层面的影响仍未得到充分表征。本研究旨在确定拟南芥（Arabidopsis thaliana）莲座叶在等光合有效辐射（PPFD）400 μmol m?2 s?1条件
摘要
入射光的光谱组成可被植物光受体感知，并能够快速重塑下游基因表达程序；然而，除已注释的miRNA外，其对小RNA层面的影响仍未得到充分表征。本研究旨在确定拟南芥（Arabidopsis thaliana）莲座叶在等光合有效辐射（PPFD）400 μmol m?2 s?1条件下暴露于蓝光、绿光、红光或白光3小时是否与特定的候选小RNA谱有关联。研究采用严格的发现与后处理流程，在已注释miRNA之外鉴定出高置信度、处理相关的候选小RNA。基于miRkwood的流程结合额外的过滤和上下文注释，恢复了一个以蓝光处理（41个候选体）为主导的紧凑候选集，而红光（8个）、绿光（6个）和白光（3个）关联的候选体较少。基因组上下文分析表明，大多数候选位点位于基因间区域，绿光条件下检测到的候选体全部位于基因间区域，并通过与转座子注释的重叠来区分源自转座子富集基因组空间的候选体。序列特征分析揭示了在5′和3′末端均存在明显的处理依赖性末端核苷酸偏好，这与光谱相关的长度类别和末端核苷酸特征变化一致，这些变化对于AGO装载假说是具有信息价值的。靶标预测突出了多个独立蓝光相关候选体共同靶向的基因子集，双链汇总显示了结构化的、类似植物的互补模式（包括频繁的10–11配对）。综上，这些结果表明，在400 μmol m?2 s?1条件下暴露于特定波长光（尤其是蓝光）3小时与拟南芥叶片中独特的可检测候选小RNA谱有关联，并鉴定出待进一步验证的候选相互作用。
引言
植物持续整合环境光信号以协调生长、代谢和胁迫适应[1]。除为光合作用提供能量外，光还作为一种信息丰富的信号，被覆盖不同（但重叠）光谱波段的光受体感知，包括光敏色素（感知红/远红光谱区域）、隐花色素和向光素（感知蓝光和紫外A光）、UVR8（感知紫外B光）以及ZTL/FKF1/LKP2受体（将蓝光与昼夜节律和发育调控耦合）[2]、[3]、[4]、[5]。大多数光受体的信号汇聚至核心转录枢纽（如COP1–SPA/HY5和以PIF为中心的模块），协调光响应基因表达程序的广泛变化[6]、[7]、[8]。下游信号快速重新编程转录程序，同时也影响转录后调控，包括RNA稳定性、翻译和可变剪接[4]、[9]、[10]、[11]。在转录后调控因子中，小RNA提供了一种快速且可扩展的层面，以响应包括光在内的环境信号重新编程基因表达程序[12]、[13]。
植物小RNA，包括miRNA和siRNA，引导含AGO的复合物通过切割或翻译抑制来调控转录本[14]、[15]、[16]，对于24nt siRNA而言，还引导RNA导向的DNA甲基化（RdDM）[17]、[18]。小RNA稳态在多个步骤受到调控（MIR转录、DCL1/HYL1/SE加工、AGO装载和周转），并可对短期环境信号作出响应[19]、[20]、[21]。光和光受体信号已被证实与miRNA生物合成和功能相关，且若干已注释的miRNA表现出光依赖和光周期依赖性应答[12]、[22]、[23]、[24]、[25]。然而，大多数研究聚焦于已知miRNA，而不同光谱制度促进发现已注释miRNA之外的额外、先前未报道的小RNA候选位点的潜力探索较少[26]、[27]、[28]、[29]。此外，假定候选位点的基因组上下文对于解读仍然重要：植物小RNA途径与转座子富集的基因组空间和表观遗传调控交织在一起，转座元件（TE）相关区域可以提供产生小RNA的底物，这些底物可能在发现流程中被捕获为形成发夹结构的候选体[13]、[30]。因此，谨慎的基因组上下文注释（基因内/基因间定位和TE重叠）对于解读由短读长sRNA-seq生成的候选位点目录至关重要。
本研究探讨了在400 μmol m?2 s?1等PPFD条件下暴露3小时，蓝光、绿光和红光是否在成熟拟南芥叶片中引发不同的小RNA特征。分析来自所得莲座叶样品的小RNA-seq数据以鉴定高置信度候选体。使用miRkwood进行发夹形成小RNA候选位点的从头鉴定[31]，采用严格的结构和表达水平过滤标准定义高置信度候选体，并进行计算机靶标预测[32]作为保守的优先排序步骤。进一步根据基因模型和转座子/TE特征（基因内/基因间、正义/反义以及TE关联）对这些候选体进行注释，以厘清其基因组来源。总体而言，该设计不仅允许评估候选位点是否在特定光照条件下被检测，还可评估其序列/长度特征是否与处理相关的长度类别和末端核苷酸模式变化一致，这些变化对于小RNA分拣假说（包括推测的AGO装载偏好性）具有信息价值。最后，TargetFinder双链比对用于汇总位置错配和G:U摆动配对模式，并量化简单的10–11配对"切割代理"，为预测相互作用中具有切割兼容性的靶向特征提供基于比对的检查。通过将严格控制的光质扰动与精选的基因组参考输出（坐标和注释表格）及透明流程相结合，本研究为未来的比较小RNA基因组学分析和定向后续验证提供了可复用资源。
章节摘要
材料与方法
植物暴露设计和小RNA-seq发现/分析流程的示意图概览见图1。
小RNA测序与数据质量
测序在全部四种光照处理中（n = 3/组）生成了深度覆盖的小RNA文库。接头修剪前后的质量控制确认了所有数据集质量一致良好，适用于下游比对和小RNA发现。Bowtie2与拟南芥TAIR10基因组的比对率在样品中稳定在70%左右，21–24 nt RNA类别显著富集，与植物小RNA文库的预期组成一致。排序
讨论
本研究旨在确定在等PPFD 400 μmol m?2 s?1条件下暴露于蓝光、绿光、红光或白光3小时是否与成熟拟南芥叶片中不同的候选小RNA谱有关联。在这些实验条件下，蓝光与不成比例的大量高置信度、蓝光相关的小RNA候选体有关联。这一富集在保守的miRkwood过滤[31]下保持稳健，并分布在
结论
在等PPFD 400 μmol m?2 s?1条件下，将六周龄拟南芥莲座叶暴露于蓝光、绿光、红光或白光三小时，揭示了与蓝光处理相关的高置信度小RNA候选体的显著富集。这些候选体以24 nt物种为主导，常表现出5′-A特征，并优先与转座子富集的基因组区域相关联。靶标预测进一步鉴定出少量基因，包括GAD2和
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CRediT作者贡献声明
Adriana Volná：写作——审阅与编辑、方法学、调查研究、概念构思。Martin Bartas：写作——初稿撰写、方法学、调查研究、形式分析。
资助
本工作由欧盟通过"公正转型"运营计划下的LERCO项目（CZ.10.03.01./00/22_003/0000003）资助。
致谢
感谢Ji?í ?erveň博士审阅稿件初稿并提出宝贵意见。感谢Martin Navrátil博士在稿件修改期间的宝贵帮助，以及关于光照处理生物物理特征鉴定的有益讨论。
Adriana Volná|Martin Bartas
捷克共和国，俄斯特拉发710 00，俄斯特拉发大学物理系
