利用RPA-CRISPR-Cas12a区分牛痘病毒的快速即时层析检测法

《Journal of Virological Methods》：Rapid Point-of-Care Lateral Flow Assay for Differentiation of Capripoxviruses Using RPA-CRISPR-Cas12a

　　

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  本研究提出了一种基于RPA（重组酶聚合酶等温扩增）并结合CRISPR-Cas12a平台的诊断工具。
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  侧向层析免疫层析法（LFA）有助于及时检测和鉴别羊痘病毒。
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  该检测方法具有快速、高灵敏度和高特异性的特点，属于即时检测性质。
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  该检测方法的特异性经过了严格评估。
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  该工具在分布式兽医诊断和现场疾病监测方面具有巨大的潜力。

章节摘要

引言

羊痘病毒（CaPVs）包括牛结节性皮肤病病毒（LSDV）、绵羊痘病毒（SPPV）和山羊痘病毒（GTPV），是一类引起具有重要经济价值病毒性疾病的重要病毒群体，分别影响全球范围内的牛、绵羊和山羊（Manjunatha Reddy等，2023）。这些病毒感染以发热、结节性皮肤病变、淋巴结肿大、生产力下降为特征，严重时可导致死亡（Bayyappa等，2025）。由于其基因组具有高度相似性

伦理声明

生物样本由合格兽医按照既定的临床实践从牛、绵羊和山羊身上采集。动物的皮肤结痂和鼻腔拭子样本在未使用麻醉的情况下采集，因为这些是无创操作，不会给动物带来不适。采集样本前已征得相应动物所有者的同意，所有操作均按照现行伦理准则

通过序列比对鉴定保守靶标区域

从NCBI数据库中检索了LSDV、SPPV和GTPV的全基因组序列，并使用MEGA11进行了多序列比对。每种物种检索了五个不同序列并提交进行多序列比对（MSA）。比对结果揭示了三种不同羊痘病毒基因组中的多个保守区域和可变区域。靶标区域在ORF 96中被鉴定，该区域在物种间具有保守性，但彼此之间存在差异（图1）。在

讨论

LSDV、SPPV和GTPV病毒已知具有高度遗传相似性、宿主适应性以及引起经济损失的能力，表现为低产量、繁殖障碍和死亡（Babiuk等，2008）。羊痘病毒感染在印度造成巨额经济损失（12.5亿印度卢比），高发病率（75-80%），以及绵羊和山羊高达50%的死亡率和小羊羔100%的死亡率（Bhanuprakash等，2011）。鉴于其重大的经济影响和快速传播

结论

本研究的总体结论是，通过将RPA与CRISPR Cas12a检测和侧向层析读数相结合，成功开发了一种针对羊痘病毒的快速、高灵敏度和种属特异性诊断平台，适用于兽医即时检测。通过对LSDV、SPPV和GTPV全基因组进行比对，ORF96被鉴定为在各物种内部保守但彼此之间存在足够差异的区域，从而能够设计种属特异性

伦理声明

本研究经印度卡纳塔克邦班加罗尔ICAR-NIVEDI（印度农业研究委员会国家兽医研究与教育培训研究所）研究所动物伦理委员会（IAEC）批准（编号：NIVEDI/IAEC/2022/06）。

作者贡献

GBMR设计了研究工作，提供了指导并进行总体监督，分析了数据并编辑了手稿。VM、MVN、BR、UJ进行了实验和实验室工作。GBMR和SN采集了样本。VN和BR撰写了手稿。GBMR和SN进行了分析并编辑了手稿，所有作者阅读并批准了最终手稿。

未引用参考文献

(Chen等，2022，Liao等，2022，Nan等，2023)

资金资助

本工作由ICAR（印度农业研究委员会）通过ICAR AINP-GETILHP资助，资助编号为ANSCNIVEDISOL202401200167。

CRediT作者贡献声明

Vignesh Manivasagam：撰写——初稿，验证，软件，方法论，形式化分析，数据管理。Megha V Naragund：可视化，验证，方法论，调查。Shivasharanappa Nayakvadi：撰写——审阅与编辑，验证，项目管理，概念设计。Brindhaa Ravindran：撰写——初稿，验证，软件，方法论。Uzma Jabeen：可视化，验证，软件，形式化分析，数据管理。Gundallahalli Bayyappa Manjunatha Reddy：

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本论文所述工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

作者衷心感谢印度农业研究委员会（ICAR）以及ICAR-NIVEDI主任提供机构设施，感谢现场兽医和动物所有者在野外样本采集期间提供的宝贵支持。

伦理声明

本研究按照ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经ICAR-NIVEDI（位于班加罗尔）研究所动物伦理委员会（IAEC）批准，

Gundallahalli Bayyappa Manjunatha Reddy | Vignesh Manivasagam | Megha V Naragund | Brindhaa Ravindran | Uzma Jabeen | Shivasharanappa Nayakvadi