基于滚动环式扩增生成的G-四链体与Au@Ti?C?T? MXene@MoSe?的交叉验证双模式适配体传感器，用于玉米赤霉烯酮的可靠检测

《Microchemical Journal》：Cross-validated dual-mode aptasensor enabled by rolling circle amplification-generated G-quadruplex and Au@Ti 3C 2T x MXene@MoSe 2 for reliable zearalenone detection

　　

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  开发了一种双模（比色/电化学）适配体传感器用于ZEN检测。
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  合成了Au@Ti₃C₂T_x MXene@MoSe₂以增强电极导电性和表面积。
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  整合了滚环扩增（RCA）以生成G-四链体用于电化学和比色读出。
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  电化学模式实现了1.23 fg/mL的检测限；比色模式实现了方便的目视筛查。
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  该传感器在真实样品中表现出优异的选择性、稳定性和回收率（89.6–106.2%）。

引言

伏马菌素（ZEN）是由镰刀菌属产生的一种非甾体类霉菌毒素，广泛污染玉米、小麦和高粱等谷物及其衍生产品[1]、[2]。ZEN具有高化学稳定性和热稳定性，使其在自然条件和常规加工过程中不易降解。因此，ZEN可通过食物链轻易在人体内蓄积，对免疫系统、神经系统和生殖系统构成潜在危害[3]、[4]、[5]。鉴于其严重的食品安全风险，许多国家和地区已制定了严格的ZEN食品和饲料最高限量标准[6]。例如，欧洲委员会法规（EC）第1881/2006号规定ZEN在谷物及谷物产品中的最高限量为75 μg/kg，婴幼儿食品中更为严格的限量为20 μg/kg[7]。中国国家标准GB 2761-2017规定ZEN在小麦、小麦粉、玉米和玉米粉中的限量为60 μg/kg[8]、[9]、[10]、[11]。因此，开发具有高灵敏度、良好选择性和适用于快速现场筛查的ZEN检测方法对于保障食品安全、加强质量控制和公众健康保护具有重要的科学意义和实用价值。

目前ZEN的分析方法主要分为仪器分析法和免疫分析技术。仪器方法以高效液相色谱（HPLC）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）为代表，具有高准确性和高灵敏度；然而，这些方法依赖昂贵的大型仪器，样品前处理繁琐且分析周期长，不适用于快速现场筛查[12]、[13]。免疫分析以酶联免疫吸附测定（ELISA）最为普遍，操作简单、通量高；然而，其固有局限性包括抗体稳定性差、易变性以及试剂成本高，此外，灵敏度不足和假阳性率高进一步限制了其在大样本筛查中的应用[14]、[15]。相比之下，电化学传感方法因其低成本、高灵敏度、快速响应和便携式设备等优点，在霉菌毒素检测领域引起了广泛关注并实现了快速发展[16]、[17]、[18]、[19]。

滚环扩增（RCA）是一种基于环状DNA模板的等温核酸扩增技术。在具有链置换活性的DNA聚合酶的持续催化下，环状模板被转化为含有多个串联重复单元的长链单链DNA[20]、[21]、[22]。在电化学适配体传感器中，RCA产物中周期性重复的适配体序列实现了高效的信号放大，因为每个重复单元都能结合电活性探针，从而将检测灵敏度提高2–3个数量级。此外，RCA具有反应条件温和和适应性强等特点[23]、[24]，已被广泛应用于医学诊断、生物传感和食品安全监测[25]、[26]、[27]。

G-四链体（G4）是一种独特的四链螺旋结构，由富含鸟嘌呤（G）的核酸序列通过Hoogsteen氢键和π–π堆积相互作用自组装形成[28]。该结构可与血卟啉结合形成具有过氧化物酶样（POD）活性的G4/血卟啉DNAzyme[29]、[30]，高效催化TMB等显色底物在过氧化氢（H₂O₂）介导下的氧化反应，产生肉眼可辨的颜色变化[31]，从而实现直观简便的比色检测。同时，G-四链体结构或其与电活性物质的复合物可通过调节电极界面的电子转移效率和介导亚甲基蓝的富集行为来产生可测量的电化学信号[32]。这种独特的双功能特性为单一分子事件驱动的双模信号输出奠定了结构基础。单一信号读出模式由于其分析原理的固有局限性，往往存在检测范围窄和抗干扰能力不足的问题[33]。比色方法操作简单、目视读出直观，适用于初步现场筛查；然而，其灵敏度相对较低，定量结果易受环境干扰和主观判断影响[34]、[35]。相比之下，电化学方法兼具高灵敏度、快速响应和易于微型化的特点[36]。在本研究中，整合G-四链体介导的比色和电化学检测具有三个关键优势：(i) 通过双独立转导实现交叉校准，消除单模干扰；(ii) 性能互补——电化学模式提供超高灵敏度（fg/mL）用于痕量定量，而比色模式实现简便操作和低成本低仪器检测；(iii) 扩展动态范围（电化学：10^?3–10⁴ pg/mL；比色：1 pM–10 μM），增强了对多样本类型的适应性。因此，这种双模设计相比传统单信号平台显著提高了准确性、可靠性和实用性。

本研究构建了一种基于双模比色和电化学检测的ZEN适配体传感器，其检测原理如图1所示。该传感器利用靶标触发的RCA高效生成G-四链体，实现比色和电化学信号的并行输出。引物被设计为包含两个关键功能结构域：其5′端与固定在电极表面的捕获探针（cDNA）互补，使后续RCA产物能够在界面处定向锚定；其3′end与锁式探针的3′端互补，而锁式探针的5′端与适配体序列互补。当固定在磁性微球上的锁式探针、引物和适配体共存时，它们组装成"磁性微球-适配体-锁式探针-引物"复合物。在ZEN存在的情况下，ZEN与磁性微球-适配体复合物之间的特异性结合触发适配体从双链结构中解离，将引物和锁式探针释放到上清液中。随后，在T4 DNA连接酶的作用下，引物和锁式探针连接形成RCA的环状模板；然后，在phi29 DNA聚合酶的驱动下，RCA反应启动，产生富含串联G-四链体重复的长链单链DNA。在电化学模式中，RCA产物通过其5′引物端与电极表面cDNA的杂交捕获在电极界面处，吸附大量亚甲基蓝（MB），产生与ZEN浓度相关的方波伏安（SWV）响应。在比色模式中，产生的G-四链体与血卟啉自组装形成DNAzyme，催化TMB显色反应，实现目视读出。为进一步提高灵敏度，在电极表面引入高导电性的Au@Ti₃C₂T_x MXene@MoSe₂纳米复合材料以增强电子转移效率。在不存在ZEN的情况下，适配体保持结合状态，RCA无法启动，不会产生G-四链体来吸附MB；因此，传感界面维持低背景信号。通过双比色和电化学信号的交叉验证，该平台有效消除了单模干扰，显著提高了检测的准确性和可靠性。

章节片段

材料和化学品

三（2-羧乙基）膦（TCEP）、乙二胺四乙酸（EDTA）、吐温-20、氯化钠（NaCl）、3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）、血卟啉、二水合钼酸钠（Na₂MoO₄·2H₂O）、氢氧化钠（NaOH）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）和硼氢化钠（NaBH₄）购自上海麦克林生化有限公司（中国上海）。三水合氯金酸（HAuCl₄·3H₂O）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。

检测原理

本研究构建了一种用于ZEN检测的双模比色和电化学适配体传感器，传感原理如图1所示。引物被设计为具有两个关键功能结构域：其5′端与固定在电极表面的捕获探针cDNA互补，使RCA产物能够在界面处定向锚定；其3′端与锁式探针的3′end互补。锁式探针的5′end与...

结论

本研究成功开发了一种用于ZEN检测的双模比色和电化学适配体传感器。该传感平台将G-四链体-ZEN识别元件的特异性与TMB显色反应的灵敏度相结合，实现了快速、低成本、无需仪器的目视检测。更重要的是，在单一平台中整合两种独立的信号转导机制不仅提供了互补的灵敏度（电化学...）

CRediT作者贡献声明

张飞（Bofei Zhang）：撰写——初稿。赵珂（Ke Zhao）：形式分析，数据整理。张宝忠（Baozhong Zhang）：撰写——审阅与编辑，项目管理，经费获取。陈博旭（Boxu Chen）：软件，调查研究。张昆锋（Kunfeng Zhang）：指导。陈涵宇（Hanyu Chen）：指导。何宝山（Baoshan He）：指导，方法论。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（编号：U1704126和41003046）、河南省科技计划项目（编号：262102321128和212102310072）、河南省自然科学基金（编号：252300420239）、粮食信息处理中心项目（KFJJ2026005）和河南工业大学创新基金计划（编号：2020ZKCJ30）的资助。

张飞（Bofei Zhang）|赵珂（Ke Zhao）|张宝忠（Baozhong Zhang）|陈博旭（Boxu Chen）|张昆锋（Kunfeng Zhang）|陈涵宇（Hanyu Chen）|何宝山（Baoshan He）