具有级联放大和自校准功能的反向信号比率型PEC-EC适配体传感器用于TNF-α的可靠检测

《Microchemical Journal》：Opposite-signal ratiometric PEC-EC aptasensor with cascade amplification and self-calibration for reliable TNF-α detection

　　

•比例型PEC-EC适体传感器将单次识别事件转化为相反方向的"关/开"信号，实现内置自校准功能。
•级联SDA-HCR扩增策略将单次识别事件转化为大量dsDNA，实现稳健的信号放大。
•ZIF-67/BiVO?复合光电极增强了光电转换效率，并提供高而稳定的光电流基底。
•实现了0.396 fg/mL的超低检测限和0.5 fg/mL至5 μg/mL的宽线性范围，可用于复杂基质中痕量生物标志物的分析。

引言
炎症是机体对感染和损伤的主要防御反应，其失调是许多严重疾病共同的病理基础。在复杂的炎症调控网络中，细胞因子是关键信号分子。其中一种重要的促炎细胞因子——肿瘤坏死因子-α（TNF-α），与类风湿关节炎、炎症性肠病等多种疾病密切相关[1],[2],[3]。因此，精确监测TNF-α浓度对于疾病的早期诊断和治疗疗效评估至关重要。

迄今为止，针对TNF-α检测已开发出多种有效的分析方法，如电化学（EC）、酶联免疫吸附测定（ELISA）和电化学发光（ECL）[4],[5],[6]。然而，这些方法往往存在成本高、步骤繁琐、易受背景信号干扰等缺点。通过将光激发与电化学检测相结合，光电化学（PEC）生物分析作为一种有前景的替代方案脱颖而出，其具有设备简易、背景噪声低和灵敏度优异等特点[7],[8]。传统PEC传感器通常依赖单信号输出模式，使得光电流信号极易受到光源强度波动和环境温度变化等干扰[9],[10]。这种脆弱性削弱了检测在分析复杂真实样品时的重复性和可靠性。

为克服单信号PEC传感器的脆弱性，双信号输出平台应运而生。常见的双模组合包括PEC-荧光（PEC?FL）、PEC-比色（PEC?CL）和PEC-EC[11],[12],[13],[14],[37]。对于PEC?FL和PEC?CL双模传感，两种信号的产生机制差异较大，导致其对干扰的敏感性不一致，自校准能力有限[15]。此外，单独的FL和CL方法的检测限通常高于PEC，这限制了PEC-FL和PEC-CL检测痕量目标物的能力。相比之下，PEC-EC具有独特的同源性，因为两种信号均源自电极界面的电子转移[16],[17]。因此，两种信号对外部干扰（如光波动和温度变化）的响应几乎同步，使PEC-EC成为双信号输出的理想选择。最近，该策略已成功应用于多种生物标志物的检测。例如，构建了一种用于多巴胺检测的EC-PEC双模传感器，在实际样品分析中实现了高精度[18]。目前，大多数PEC-EC双模传感器将两种信号作为独立的读数，本质上易受光强度漂移、温度波动和电极间差异等外部干扰。为解决这一局限，引入了比例型传感策略，即利用两种信号的比值消除干扰因素并提高检测可靠性[19]。当两种信号在目标结合时呈相反方向变化——一个增强另一个抑制时，该策略被称为反信号比例型传感。这种设计能有效增强目标特异性信号同时抑制背景信号，目前已在多种检测平台上得到验证。

在ECL/SERS领域，Guo等人利用目标触发的DNA立方体-轨道界面重构，实现了相反方向的ECL增强和SERS衰减，在0.1–1000 pM范围内检测NF-κB p50，检测限为2.3 fM[20]。在FL/ECL领域，Feng等人构建了一种基于两步共振能量转移的比例型生物传感器，通过FL"关闭"和ECL"开启"响应实现了金黄色葡萄球菌的单细胞水平检测[21]。在ECL/EC系统中，Peng等人将熵驱动的DNA行走机器与自反馈放大电路相结合，实现了"开启"ECL和"关闭"EC的比例型检测，检测限低至18 aM[22],[33]。在电化学比例型传感中，Liu等人通过改变DNA双链上二茂铁的位点实现了可编程的分析功能，支持"On/Off"和"On/Constant"两种响应模式[23]。

相比之下，反信号比例型策略在光电化学（PEC）传感中的应用相对有限。PEC与EC结合的本征优势在于两种信号均源于同一电极界面的电子转移，使其对外部干扰具有良好的同步响应能力[16],[17]。反信号设计进一步扩展了比值的动态范围，超越任一单一信号，从而在保持自校准的同时提升灵敏度。对于超低丰度生物标志物的检测，"信号开/关"比例型原理尤为强大，因为此时可靠性与灵敏度同样关键[19]。Liu等人基于金纳米棒敏化的CdTe量子点复合物构建了EC-PEC双模比例型适体传感器用于赭曲霉毒素检测，其中目标诱导的适体构象变化产生EC"关闭"和PEC"开启"响应，检测限为30 pg/mL[24]。

尽管取得了这些进展，现有传感器的灵敏度仍不足以用于痕量分析。将单次目标识别事件转化为强而可靠的信号对于实现超高灵敏度至关重要，这依赖于高效的信号放大策略。在此背景下，人们探索了多种信号放大策略，包括杂交链式反应（HCR）、催化发夹组装（CHA）、滚动环扩增（RCA）和链置换扩增（SDA）。其中，HCR因其无酶特性、温和的反应条件、高效的扩增能力和灵活的设计而备受青睐[25],[26]。HCR的基本原理是：一条特定的DNA起始链触发两个发夹DNA探针之间交替且自发的链置换杂交，最终形成长的双链DNA聚合物[27]。通过合理设计发夹探针序列，可将目标识别事件转化为起始链的释放，从而启动HCR实现指数级信号放大[28]。这种强大的放大能力使HCR成为构建超高灵敏度生物传感器的理想工具。

高性能PEC传感平台的开发依赖于高质量的基底材料。在PEC传感中，无机半导体材料（如TiO?、ZnO、CdS）常是研究的重点。不幸的是，许多材料存在光生载流子复合率高、生物相容性差或光腐蚀等问题。BiVO?具有合适的带隙和良好的可见光响应性，但其较低的电荷分离效率限制了光电转换性能[29]。应对该问题的有效策略是将BiVO?与其他功能性材料复合。传统复合物，如BiVO?与贵金属（Au、Ag）或碳材料（石墨烯）的结合，在一定程度上能促进电荷分离[18],[31]。但这些无机材料的刚性结构以及与BiVO?的界面接触问题往往导致分离效率不理想和电荷传输阻力偏高。为克服这些局限，具有可调结构和更好界面兼容性的有机-无机杂化材料日益受到关注。最近，金属有机框架（MOFs）展示了可观的前景，这主要归功于其高比表面积、可调孔径和可设计的结构[32]。在众多MOFs中，沸石咪唑酯骨架材料-67（ZIF-67）特别引人注目，得益于其易于合成、良好的化学稳定性和钴中心的优异电化学活性[22],[33]。更重要的是，ZIF-67与BiVO?具有良好的带对齐关系。ZIF-67的多孔骨架通过其与BiVO?的结合可承载生物识别元件，同时两种材料之间形成的紧密接触促进了光生载流子的高效分离与迁移[34],[35]。

在此，我们开发了一种PEC-EC比例型传感器，通过级联CHA-HCR扩增方案结合BiVO?/ZIF-67复合物实现对TNF-α的超灵敏测量。如图1所示，链霉亲和素修饰的磁性微珠与生物素修饰的适体连接，实现对TNF-α的特异性捕获。当目标结合后，TNF-α被适体识别，导致与适体预先杂合的互补DNA（cDNA）链释放。这是因为适体-分析物复合物的稳定性高于适体-cDNA双链。释放的cDNA迁移至电极表面，通过链置换反应触发预先固定的发夹探针H1。打开的H1随后与H2杂合，释放cDNA链并形成H1-H2双链。释放的cDNA随后可触发另一个H1发夹，从而开启新一轮的链置换。同时，H2上暴露的序列启动H3和H4的交替组装，进而通过HCR在局部生成长的双链DNA（dsDNA）链。级联组装产生两种不同的信号输出。延长的dsDNA链在电极界面产生显著的位阻，导致PEC光电流下降；而长dsDNA链作为固定大量亚甲基蓝（MB）的理想平台，MB作为信号物质从而产生增强的EC差分脉冲伏安法信号。重要的是，两种信号对目标浓度的响应方向相反（PEC关闭、EC开启），使得比例型读数（I_EC/I_PEC）具有内在自校准能力，可有效对抗外部干扰并提供内置验证。该设计以高可靠性实现了对TNF-α的超灵敏检测，为复杂生物基质中的精确生物标志物分析提供了稳健的方法。

小节片段

化学品与仪器
所有化学品均为分析纯级，详细规格见补充材料。

BiVO?和ZIF-67的合成
BiVO?和ZIF-67的合成详情见补充材料。

磁性微珠上的目标捕获与链置换反应
向离心管中加入12 μL链霉亲和素偶联磁性微珠（10 mg/mL），随后用1 mL洗涤缓冲液（10 mM Tris-HCl、1 mM EDTA、1 M NaCl和0.1% Tween 20，pH 7.5）洗涤三次。然后加入50 μL生物素修饰的TNF-α适体（1 μM），混合物随后

电极材料的表征
BiVO?和ZIF-67的晶体结构和形貌通过粉末X射线衍射（PXRD）、扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM）进行表征。在图1A中，在18.679°、28.967°和34.512°处观察到衍射峰，对应于BiVO?（JCPDS编号75-1866）的(101)、(112)和(200)晶面。ZIF-67在7.4°、10.4°和12.8°处的特征峰对应于(011)、(002)和(112)晶面。

结论
总之，成功构建了一种高灵敏、高可靠的PEC-EC比例型适体传感器用于TNF-α检测。该传感器整合了BiVO?/ZIF-67复合界面与目标触发的级联CHA-HCR扩增策略。每一次目标识别事件都被转化为延伸dsDNA链的组装，产生位阻抑制的PEC信号和MB放大的EC信号。比例型读数I_EC/I_PEC提供内在自校准能力，有效

CRediT作者贡献声明
赵琴威：初稿撰写、可视化、数据整理。苏宇航：软件。汤颖：形式分析。唐兴：调研。陈诺：软件。罗怡彤：数据整理。朱丽萍：概念构思。熊晓莉：概念构思。高瑶：审阅与编辑、概念构思。

未引用参考文献
[30]

利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文所报告工作的已知的竞争性经济利益或个人关系。

致谢
本工作得到四川师范大学大学生创新创业训练计划项目（编号202610636018）的资金支持。

赵琴威 | 苏宇航 | 汤颖 | 唐兴 | 陈诺 | 罗怡彤 | 朱丽萍 | 熊晓莉 | 高瑶