通过配体诱导组装构建可编程级联脱氧核酶平台用于妥布霉素的灵敏检测

《Microchemical Journal》：Engineering a programmable cascaded DNAzyme platform for sensitive detection of tobramycin via ligand-induced assembly

　　

• 设计了一种新颖的级联双DNA酶扩增平台。
• 该适体传感器采用非竞争性、无链置换的转导机制。
• 该适体传感器表现出优异的分析性能，检出限（LOD）为21.0 nM。
• 在真实食品样品中的实际应用性得到了验证

引言

抗生素长期以来一直是临床治疗和畜牧业促生长的基石；然而，这些药物的广泛应用使得抗生素残留问题引起了越来越多的关注[1]。作为氨基糖苷类抗生素家族的一员，妥布霉素（Tobramycin，TOB）在临床上被广泛用于治疗由易感细菌病原体引起的严重感染。特别是，它对革兰氏阴性菌引发的呼吸道感染、泌尿道感染和严重软组织感染具有显著的治疗效果。其药理学机制依赖于TOB与细菌30S核糖体亚基上的受体蛋白结合；该相互作用会破坏70S核糖体复合物的组装，损害mRNA翻译过程，从而对细菌蛋白质合成产生抑制作用[2]、[3]。鉴于其优良的溶解性和广谱抗菌特性，TOB在畜牧业、临床医学和水产养殖三大关键领域被广泛使用[4]、[5]、[6]。TOB是一种具有浓度依赖性抗菌活性的抗生素。然而，该药物的不当或不规范使用可能引发严重且不可逆的不良反应。TOB的主要毒性效应包括肾毒性和耳毒性，以及恶心和呕吐等胃肠道表现，还有皮疹和瘙痒等超敏反应[7]、[8]。TOB在不同领域的无节制使用已导致其持续在环境中积累，这一现象可能对人类健康构成重大风险。

目前有多种传统技术可用于TOB检测，包括分光光度法[9]、免疫分析[10]、毛细管电泳[11]、离子色谱法[12]、液相色谱法[13]、化学发光法[14]和色谱-质谱联用法[15]。尽管这些方法应用广泛，但它们都存在明显的局限性。TOB和其他氨基糖苷类抗生素的分子结构中不含发色团和荧光团，且由于含有多个氨基和羟基官能团而具有高极性[16]。因此，在样品前处理和色谱分析过程中，定量测定面临严峻挑战。显然，为了提高分析物的挥发性，衍生化是气相色谱（GC）分析的必要前置步骤；同样，通过柱前或柱后衍生化引入发色团或荧光团基团对于液相色谱（LC）结合光学检测也是不可或缺的。正因如此，传统且成熟的TOB检测方法——如高效液相色谱法（HPLC）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）——存在诸多不足，包括繁琐的衍生化步骤、复杂的样品前处理、昂贵的仪器设备、漫长的检测时间以及对专业操作人员的依赖。分光光度法的检测灵敏度不足，化学发光分析则存在选择性差的问题。就酶联免疫吸附测定（ELISA）而言，对特异性抗体的依赖带来了一些固有缺陷，包括抗体制备成本高以及在非最佳条件下容易发生抗体变性。因此，迫切需要开发一种简便、快速、高灵敏度和高选择性的TOB检测方法。

适体是通过系统性进化筛选指数级配体富集（SELEX）技术体外筛选获得的单链DNA或RNA分子[17]。SELEX能够筛选出对蛋白质、小分子、金属离子甚至细胞等广泛靶标具有高亲和力和特异性的适体[18]、[19]、[20]。与抗体相比，基于适体的体系在传感领域具有多项竞争优势[21]。商业化合成的适体具有低成本、优异的批间重现性和高纯度，且其骨架可以方便地修饰功能性基团。值得注意的是，DNA适体表现出优异的化学稳定性。此外，靶标结合引起的适体构象变化使得具有增强灵敏度、高选择性和多样化结构设计的生物传感器的构建成为可能[22]、[23]、[24]。自从筛选出具有高亲和力的TOB DNA适体以来[25]，已开发并报道了多种具有不同信号输出模式的适体传感器用于TOB的特异性检测，包括比色法[26]、荧光法[27]、共振散射光谱法（RSS）[28]和电化学法[25]。在这些技术中，荧光生物传感器具有检测便捷、测量模式多样化以及大量可用于核酸修饰的荧光团等优点[29]、[30]。在荧光适体传感器的设计中，信号增强和背景抑制策略是实现高灵敏度靶标检测的关键前提。核酸信号扩增策略——如RNA切割型DNA酶——可以有效增强荧光适体传感器的输出信号，因为这些催化DNA分子在特定金属离子存在下能够快速且高效地驱动其互补DNA底物中嵌入的单RNA链的连续切割[31]、[32]。DNA酶凭借其独特而优异的特性——卓越的化学和热稳定性、强特异性、高催化效率和简便的制备方法——在多种生物医学和生物传感器应用中受到了广泛关注[33]。目前，基于DNA酶的TOB检测方法仅在少数研究中有所报道。例如，Zhao等人构建了一种电化学适体传感器，将外切酶III（Exo III）辅助回收、Mg2?依赖性DNA酶循环切割和杂交链反应（HCR）进行信号扩增整合在一起。TOB与发卡探针HP1中的适体结合，触发Exo III介导的消化反应以释放DNA酶链。这些DNA酶切割金电极上的底物发卡（HP3），启动MB标记发卡（HP4/HP5）的HCR以增强电化学信号。其线性范围为5–1000 nM，检出限（LOD）为3.51 nM，并应用于牛奶样品分析[34]。该TOB电化学适体传感器通过Exo III、DNA酶和HCR的协同信号扩增实现了高灵敏度，对干扰抗生素具有优异的选择性，并在真实牛奶样品中表现出可靠的性能，但涉及多个需要精确温度控制的实验步骤，并且依赖于Exo III酶，这增加了试剂的复杂性和潜在成本。最近，Zhang等人开发了一种基于ZnCr-LDH@MXene作为电极材料的比率电化学生物传感器，使用FeS?@MIL-101(Fe)（过氧化物酶模拟纳米酶）和亚甲基蓝（MB，氧化还原指示剂）作为双信号分子。靶标触发的Mg2?依赖性DNA酶纳米探针驱动循环DNA步行者进行信号扩增。线性范围为100 fM–100 nM，超低LOD为26 fM，并在牛奶和湖水样品中得到了验证[35]。该TOB比率电化学生物传感器具有超越大多数报道方法的超高灵敏度，比率双信号输出保证了高稳定性和准确性，良好的重现性以及适用于多种真实样品的能力，但涉及ZnCr-LDH@MXene和FeS?@MIL-101(Fe)纳米材料的复杂合成。此外，这些配体和核酸的转导均基于配体与其互补序列之间相互竞争的策略，因此其转导效率或多或少会受到一定程度的影响。我们此前开发了一种高效、通用且动力学调控的配体-寡核苷酸转导平台，用于消除释放链中的序列依赖性，证明靶标结合驱动适体从无序柔性构象转变为致密刚性构象，从而显著加速了核酸链组装和链置换动力学[36]。该平台促进了小分子化合物和蛋白质的有效转导至任意随机链，无论其序列如何。此外，通过利用该平台，我们已实现了配体调控的复杂核酸通讯[37]。然而，该平台仍然涉及一个不能完全进行的链置换反应，在一定程度上降低了传感器的灵敏度。因此，开发一种新型的配体-核酸转导平台以实现灵敏的靶标检测至关重要。

目前，研究人员将完整DNA酶的催化核心分割为两个或多个独立亚基——即分裂DNA酶——以提升DNA酶在生物分析应用中的灵活性和功能性[38]、[39]、[40]、[41]。每个单独亚基均保持失活状态，因为它们仅包含部分酶结构域。此外，引入特定的核酸序列基序作为输入端赋予了可自由切割的DNA酶适用于核酸检测的潜力，同时还能够精确区分仅含单个碱基错配的核酸变体[42]、[43]、[44]。因此，我们假设将适体插入输入链中可以实现配体诱导的分裂DNA酶组装，从而激活其切割活性，实现非核酸靶标的更高效转导和高灵敏度检测。

在本工作中，我们利用分裂DNA酶来促进小分子配体向功能完整的DNA酶的转化。通过两步核酸扩增策略，我们进一步实现了在均相水溶液中靶标配体TOB的高灵敏度和高选择性检测。首先，我们将常用的E6型DNA酶切割为两个独立的亚基（图1）。这种Mg2?依赖性DNA酶介导带有核糖核苷酸（rA）的DNA底物以及RNA底物的水解切割，催化速率为0.01 min?1 [45]。这两个亚基（分别称为DNA酶-1和DNA酶-2）无法组装成具有功能活性的DNA酶，这主要归因于底物与各个亚基之间的碱基互补性不足。我们引入了一个由TOB靶向适体和与两个分裂DNA酶亚基互补的识别臂组成的输入链。当适体与TOB结合时，核酸适体发生构象转变，从松散无序的构象转变为刚性致密的结构。这种结构变化驱动了由输入链和两个亚基组成的三元复合物的形成，该复合物获得了显著增强的稳定性。该稳定化复合物进而使得效应链能够促进分裂DNA酶催化核心（灰色高亮显示）的正确组装，最终恢复了DNA酶的底物切割活性。据此，我们设计了释放的底物作为二级DNA酶；随后的两步扩增策略因此实现了TOB的高灵敏度检测，检出限达到亚纳摩尔级别。如此卓越的分析性能使所开发的平台非常适合食品工业和制药工业中的TOB监测应用。

材料与方法

材料

抗生素，包括TOB、庆大霉素（KAN）、头孢氨苄（CFAL）、头孢克肟（CFX）、四环素（TET）、氯霉素（CAP）和链霉素（STR），均购自上海阿拉丁生化科技有限公司。无机盐和有机试剂，即氯化钠（NaCl）、氯化镁（MgCl?）、Tris和乙二胺四乙酸（EDTA），均购自上海试剂公司（中国上海）。所有试剂均为分析纯并直接使用

基于新颖的级联双DNA酶放大器构建的高灵敏TOB传感平台

基于已报道的E6 DNA酶可被核酸（NA）输入调控并可分割为两个组分（E6 DNA酶-1和E6 DNA酶-2）的发现[39]，我们假设非核酸配体（如小分子）是否能够调控DNA酶活性。随后，我们将一个带有短茎（黄色）的核酸适体（蓝色）插入输入链中。在没有配体存在时，适体采取松散无序的构象，无法形成稳定的三链复合

结论

传统适体传感器依赖于基于平衡的竞争性反应或toehold介导的链置换反应，其效率永远无法达到100%，从而限制了灵敏度。在本工作中，我们成功构建了一个可编程的级联双DNA酶扩增平台，用于TOB的高灵敏度和高选择性检测。该设计独特地将分裂E6 DNA酶的配体诱导组装策略与8-17 DNA酶介导的二级扩增相结合，实现了高效的转导

CRediT作者贡献声明

王敏：资源、项目管理、方法论、正式分析、数据管理。吴慧斌：软件、资源、方法论、数据管理。杨雪：资源、方法论、数据管理。张思祥：软件、方法论、数据管理。王沁欣：方法论、数据管理。栾广向：监督、软件、资源、方法论、数据管理。李航：验证、监督、调查。曾智：论文撰写-审阅与编辑、论文撰写-初稿撰写、项目……

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文所报道工作的任何已知的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢福建省自然科学基金[2024 J01869, 2026 J0011058]、莆田学院高层次人才启动基金（2023056, 2025038）以及青海省自然科学基金（2025-QY-226）的资助。

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