更灵敏还是更简便？基于胶体金免疫层析试纸条检测植物油中黄曲霉毒素B1的预处理策略比较研究

《Microchemical Journal》：More sensitive or simpler? A comparative study of Pretreatment strategies for AFB 1 detection in plant oils using a colloidal gold immunoassay strip

　　

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  开发了两种互补的前处理方法，用于植物油中黄曲霉毒素B?（AFB₁）的灵敏检测或快速筛查。
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  蒸发富集实现了10倍浓缩，视觉检测限为5 μg/kg。
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  一种无需离心即可直接条带检测的方法，在六种植物油中1分钟内即可完成检测。
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  超快速方案成功追踪了紫外线下AFB₁光解动力学的实时变化。

引言

黄曲霉毒素B?（AFB₁）是一种普遍存在的高毒性真菌毒素，主要由曲霉属（Aspergillus）真菌产生，常作为污染物出现在油料作物和食用植物油中。植物油中的AFB₁污染通常来源于受感染的原始籽粒，且即使在工业精炼过程中也可能残留[1]。由于其高脂溶性和显著的热稳定性，食用油中残留的AFB₁对公众健康构成严重威胁，这主要归因于其强肝毒性及其被世界卫生组织国际癌症研究机构（IARC）列为第一类人类致癌物的特性[2]。一项针对广东省散装花生油的市场调查显示，AFB₁检出率为79.72%，污染水平从0.02到174.13 μg/kg不等[3]。为保护消费者，监管机构已制定AFB₁最大残留限量（MRL）：花生油和玉米油为20 μg/kg，其他植物油为更严格的10 μg/kg。

传统监测方法主要依赖高性能液相色谱法（HPLC）和液相色谱-串联质谱法（LC-MS/MS）等仪器分析手段。尽管这些方法灵敏度和精密度高，但需要训练有素的人员进行复杂、耗时且劳动密集型的样品前处理[4]。使用免疫亲和柱（IAC）或固相萃取（SPE）小柱进行样品净化会增加每次分析的成本，并产生大量有害有机废物[5]。此外，整个前处理流程包含均质化、提取、洗涤、洗脱、蒸发和复溶等多个步骤，耗时经常超过数小时，使得这些传统方法不适合大批量农业产品的高通量或现场筛查。

因此，迫切需要开发既能减少人工操作又不牺牲可靠性的快速、经济的筛查替代方法。傅里叶变换近红外（FT-NIR）光谱法已成为花生油中AFB₁无损筛查的候选技术[6]、[7]。然而，其预测精度会因维生素E、多酚、类胡萝卜素和叶绿素等固有基质成分而严重降低[8]。由于基质差异显著，每种油类都必须独立建立不同的校准模型，限制了其现场通用性。

免疫分析方法，特别是侧向流免疫层析试纸条（ICS），为现场部署筛查提供了一种有吸引力的框架。对于工业批量处理，全自动或免前处理的定量策略备受青睐，以减少人为干预。例如，Ni等人（2024年）开发了一种基于磁珠的自动化化学发光免疫分析法，无需样品前处理即可在食用油中检测AFB₁和玉米赤霉烯酮（ZEN）[9]。类似地，Huang等人建立了一种10分钟提取方案，采用免疫磁珠联用分子印迹固相萃取进行多目标物富集[10]。然而，许多所谓的"免前处理"方法仅仅是消除了离心步骤，但仍需要单独的磁分离阶段或复杂的试剂配制，这削弱了其在现场使用的实际简便性。

在操作简化的同时，大量研究致力于通过信号放大来提高ICS的灵敏度[11]。Wang等人利用Cu???Se-Au纳米粒子构建了光热传感器探针，与传统比色读数相比，对谷物样品的灵敏度提高了11.88倍[12]。Zhang等人应用了类似的CoS@TA纳米球光热策略，将检测限（LOD）在肉眼检测的基础上提高了近20倍。其他策略包括双探针信号放大[13]、多层磁性量子点纳米微球[14]、链霉亲和素修饰磁珠[15]以及荧光纳米结构[16]。尽管取得了这些进展，现有免疫分析法在食用油样品中的通量仍受限于繁复的提取步骤，这些步骤需要离心和精确的多步移液操作。与上述需要精密探针合成、纳米材料功能化或额外反应步骤的信号放大策略不同，蒸发预富集方法可以通过简单的物理溶剂去除实现灵敏度提升。该策略无需额外的探针制备成本，避免了复杂的孵育/洗涤程序，且完全兼容我们耐溶剂的抗体，为实验室常规筛查提供了一种更实用的替代方案。

免前处理的侧向流检测已成功应用于瘦肉精类小分子污染物（如莱克多巴胺和克伦特罗）在简单基质（如猪尿）中的检测[17]。将此类工作流程应用于复杂疏水基质的主要瓶颈在于识别抗体的有机溶剂耐受性和抗基质干扰能力。我们实验室此前制备了一种新型抗AFB₁单克隆抗体（mAb），在有机介质中表现出优异的稳定性[18]。这一独特特性促使我们探讨液-液油提取物是否可以在不经过传统液-液分离或离心步骤的情况下直接应用于ICS。

本研究针对植物油中AFB₁分析，开发了两种互补的样品前处理策略，在灵敏度和操作通量之间提供了战略性平衡。第一种策略采用有机溶剂提取结合旋转蒸发对目标物进行10倍预富集，建立了我们ICS系统的极限灵敏度边界。第二种策略引入了一种超快速的免离心方法，允许将原始油样与纯甲醇和PBST混合后1分钟内直接上样于试纸条。该超快速方案在多种植物油脂基质中经过严格验证。此外，我们利用超快速方案的快速反馈回路，展示了其作为过程分析工具在紫外脱毒处理中实时监测AFB₁光降解动力学的实用性。

章节摘要

材料仪器

黄曲霉毒素B?（AFB₁）购自青岛普博莱生物科技有限公司（中国青岛）。抗AFB₁抗体为本实验室先前制备[18]。聚碳酸酯（PVC）底板、样品垫和吸收垫购自上海杰毅生物科技有限公司（中国上海）。硝酸纤维素（NC）膜（Unisart CN140）购自Sartorius Stedim Biotech GmbH（德国哥廷根）。切条器（ZQ2002）和压条机（HM 3030）购自

有机溶剂对试纸条免疫层析的影响

短链脂肪醇和酮类（如甲醇、丙酮、乙醇和乙腈）是从农产品中提取AFB₁的标准溶剂[19]。然而，高浓度有机溶剂通常通过破坏控制抗体-抗原结合构象的弱非共价力，从而干扰侧向流免疫分析。

虽然常规工作流程依赖于70%水-甲醇混合液，我们评估了一系列有机溶剂浓度百分比以

结论

本研究开发并严格评估了两种针对不同终端用户需求的食用油中AFB₁检测的前处理策略。蒸发法实现了目标分析物的10倍预富集。相反，超快速方案表明，我们此前制备的单克隆抗体的高有机溶剂耐受性使得完全消除离心和液-液分离成为可能

CRediT作者贡献声明

周亚霖：数据整理。金美玲：验证、数据整理。袁建：资源。李光磊：方法学。钱凯：正式分析。严文静：验证、数据整理。邢常瑞：初稿撰写、方法学、概念构思。

利益冲突声明

作者声明，他们没有已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本研究获得国家市场监督管理总局食品接触材料安全重点实验室（WJ202510R06）、国家自然科学基金（32272418）、江苏省市场监督管理局科技计划项目（KJ2025008）以及江苏高校优势学科建设工程项目（PAPD）的资助。

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