SlGH9-16纤维素酶在番茄雌蕊形态建成与果实质地中的作用

《Plant Physiology and Biochemistry》：The role of SlGH9-16 cellulase in gynoecium morphogenesis and fruit texture in tomato

　　

摘要翻译：
花发育涉及由细胞壁的协同合成、分解和重塑过程驱动的动态变化，这些过程支持细胞分裂、分化和扩张。内切-1,4-β-葡聚糖酶（EGases或纤维素酶），属于糖苷水解酶家族9（GH9），是参与细胞壁解聚和代谢以及细胞扩张和分化、果实成熟和器官脱落的关键酶。然而，它们在雌性生殖发育过程中的作用仍知之甚少。在本研究中，研究人员研究了纤维素酶SlGH9-16在番茄雌蕊和果实发育过程中的功能。SlGH9-16及其直系同源基因AtGH9B2和AtGH9B13的表达谱分析显示，这三个GH9成员在雌性生殖器官中具有保守且动态的时空表达模式。研究人员还生成了SlGH9-16的CRISPR-Cas9突变体和过表达（OE）株系，并表明该酶对于番茄雌蕊的正常细胞模式和形态建成是必需的。此外，SlGH9-16作为剂量依赖性调节因子影响果实结构和质地，其功能缺失显著延长了采后货架期。FT-IR和HPTLC分析表明，这些表型变化与果皮细胞壁多糖基质中 distinct 的化学变化相关。总之，这些发现强调了GH9纤维素酶在生殖发育中的作用，以及内切-1,4-β-葡聚糖酶在番茄雌蕊和果实形态建成中的重要性。

论文解读文章：

**研究背景与科学问题**

植物细胞壁是动态的、代谢活跃的结构，其合成、分解和重塑过程在花发育中至关重要，为细胞分裂、分化和扩张提供机械支持。糖苷水解酶家族9（GH9）成员，即内切-1,4-β-葡聚糖酶（纤维素酶），是细胞壁降解和重塑的关键酶，已知参与细胞伸长、分化、器官脱落、果实成熟等过程。尽管GH9纤维素酶在营养组织和果实成熟中的作用已有较多研究，但它们在雌性生殖器官（雌蕊）发育中的功能尚不明确。番茄作为研究肉质果实的模式植物，其雌蕊形态建成和果实发育涉及剧烈的细胞壁动态变化，这为探究GH9纤维素酶在生殖发育中的功能提供了理想体系。该研究旨在解析SlGH9-16在番茄雌蕊形态建成和果实质地调控中的作用，并探究其潜在的生物技术应用价值。

**研究内容与主要方法**

研究人员首先通过生物信息学分析鉴定了番茄SlGH9-16与其拟南芥直系同源基因AtGH9B2和AtGH9B13的进化关系，利用转录组数据分析和实验手段（拟南芥启动子报告基因融合系、番茄mRNA原位杂交）比较了三个基因在生殖器官中的时空表达模式。在功能研究方面，研究人员利用CRISPR-Cas9技术构建了SlGH9-16敲除突变体（slgh916-cr1和slgh916-cr2），并通过农杆菌介导的遗传转化获得了SlGH9-16过表达（OE）株系（35S::SlGH916-1和35S::SlGH916-21）。对花和果实进行了形态学和组织学分析，包括扫描电子显微镜（SEM）、半薄切片组织化学染色、光学显微镜观察和形态计量学统计。果实性状评估包括使用果实压力测试仪测定成熟绿（MG）和红熟（RR）期的果实硬度，使用番茄分析仪软件分析果实形状指数和果顶突出度，并开展采后货架期实验。为解析细胞壁化学成分变化，研究人员采用了衰减全反射-傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）结合主成分分析（PCA），以及酸水解结合高效薄层色谱（HPTLC）和光密度分析。所有实验均以番茄品种Micro-Tom（MT-WT）作为野生型对照，拟南芥材料为Col-0生态型。

**研究结果**

**1. 拟南芥和番茄纤维素酶在花发育过程中呈现保守的时空表达模式**

通过蛋白质序列比对，SlGH9-16与AtGH9B2具有74%的氨基酸一致性，与AtGH9B13（拟南芥旁系同源基因）具有80%一致性。公开转录组数据和实验检测显示，三个基因均在花发育早期表达量最高，随后逐渐降低。在拟南芥雌蕊中，pAtGH9B2活性广泛分布于内侧域和外侧域（包括心皮边缘分生组织CMM、瓣片、中柱和胚珠），而pAtGH9B13活性主要局限于内侧域并随发育进程逐渐减弱。在番茄中，SlGH9-16转录本早期定位于幼嫩生殖组织（胎盘、心皮、雄蕊），中期局限于胚珠、花柱和柱头，后期在子房中显著减少，几乎仅在花柱和柱头中积累。

**2. 拟南芥和番茄GH9纤维素酶的功能鉴定**

拟南芥插入突变体未能产生明确的基因功能缺失表型，且过量表达AtGH9B2或AtGH9B13未导致形态变化，因此研究人员将功能研究聚焦于番茄SlGH9-16。CRISPR-Cas9突变体slgh916-cr1和slgh916-cr2分别携带115 bp和260 bp的缺失，导致提前终止密码子产生截短蛋白，完全破坏了GH9催化结构域中高度保守的组氨酸和天冬氨酸/谷氨酸催化基序。

**3. SlGH9-16是番茄雌蕊正常细胞模式和形态建成所必需的**

在开花期，突变体花柱显著增宽（slgh916-cr1为0.45 mm，slgh916-cr2为0.42 mm，野生型为0.35 mm），细胞层数增加（突变体50层，野生型44层）；而过表达株系花柱变窄（0.31 mm）且细胞层数减少（38–41层）。细胞宽度在突变体中与野生型相近，但在过表达株系中显著增加。子房组织学分析显示，突变体果皮显著增厚（约147–155 μm，野生型为111 μm）且细胞层数由10层增至13层；过表达株系果皮厚度与野生型相近（约99–103 μm）但细胞层数减少至8层，同时果皮细胞面积显著增大，表明过表达导致细胞扩张的补偿效应。

**4. SlGH9-16株系的果实硬度和形态分析**

果实硬度测定显示，突变体在MG期果实硬度显著高于野生型（21.22 N和19.5 N对比13.6 N），RR期也保持较高硬度（2.8 N对比2.39 N）；过表达株系MG期硬度与野生型无显著差异（12.35 N和12.7 N），RR期轻微低于野生型（2.0 N）。果实形状分析表明，过表达株系果实更 elongated，果形指数（外部I型）中位数达0.95–1.02，而野生型和突变体为0.86–0.89；过表达株系果实花柱端明显突出（远端突出值0.8–1.17，野生型和突变体为0），呈现尖形末端。

**5. 成熟绿果实果皮的傅里叶变换红外光谱和化学计量学分析**

ATR-FTIR光谱显示，突变体slgh916-cr1在1030–1050 cm^-1区域（纤维素和半纤维素C-O、C-C伸缩振动）信号强度显著降低，在约3300 cm^-1的羟基伸缩带强度也下降，表明细胞壁基质组成改变；过表达株系光谱与野生型基本一致。3D-PCA得分图显示，前三个主成分解释了92%的方差（PC1=44.7%，PC2=30.8%，PC3=16.5%），野生型和过表达株系聚类重叠，而突变体明显分离。

**6. HPTLC色谱剖面和光密度分析**

HPTLC分析表明，经15% H₂SO₄酸水解后，所有基因型中均检测到与纤维二糖标准品共迁移的条带。光密度分析显示，突变体中该条带的积分信号（Raw Volume）最高（1,358），野生型次之（644），过表达株系最低（374），相对于纤维二糖标准品信号分别约占14.8%、7.0%和4.1%，表明突变体果皮中纤维二糖兼容性组分的相对丰度更高。

**7. SlGH9-16红熟果实的采后评价**

采后贮藏实验（每周记录，持续4周）显示，第一周结束时仅8%的野生型果实保持完整，而突变体分别为44%和48%；过表达株系仅12%和8%保持膨压，与野生型相似。第二周结束时，所有野生型和过表达果实完全脱水，而突变体仍有20%和16%保持坚实。突变体果实能够维持结构完整性长达两周，而野生型和过表达株系在7天内迅速失水皱缩。

**讨论与结论**

GH9纤维素酶在雌蕊发育早期阶段表达。本研究发现AtGH9B2表达范围比先前报道的更广（从第6至12阶段），且首次分析了AtGH9B13的表达（局限于内侧域）。这些表达域与已知的雌蕊形态建成关键调控因子（如SPT、ETT、NTT等转录因子和植物激素信号）高度重叠，提示GH9纤维素酶可能作为这些遗传程序的直接机械效应器。SlGH9-16通过影响细胞壁完整性调节雌蕊和果实的组织架构。突变体中细胞壁刚度增加导致细胞层数增多（增生），而过表达则减少细胞层数并由细胞面积增大补偿，表明细胞壁完整性可能作为决定花柱和子房细胞层数的检查点。过表达株系果实尖形末端可能是由于过量纤维素酶削弱了花柱端支持组织，使其在膨压作用下变形。SlGH9-16功能缺失显著增强果实硬度和延长货架期，其机制涉及果皮细胞层数增加和细胞壁酶解减少，FT-IR和HPTLC数据支持细胞壁结构组成的改变。鉴于果实硬度与货架期是重要经济性状，SlGH9-16可作为改良番茄采后品质的潜在靶点，但需进一步评估其在商业品种中对风味和营养品质的影响。

研究结论：SlGH9-16通过改变细胞壁机械特性，成为番茄雌蕊和果实结构的重要调节因子。其活性作为一种发育检查点：功能缺失导致细胞壁更僵硬并引起增生，而过量表达则损害结构稳定性并影响果实外观。此外，功能缺失突变体增加的果实硬度和货架期展示了该基因在优化番茄采后品质方面的生物技术潜力。