Pichia caribbica 通过影响组蛋白乙酰化来调节磷脂酰肌醇信号通路，从而缓解库尔拉香梨采后出现的黑头病

《Postharvest Biology and Technology》：Pichia caribbica influences histone acetylation to modulate phosphatidylinositol signaling against postharvest blackhead in Korla fragrant pears

　　•Pichia caribbica 可以抑制库尔勒香梨的采后黑头病。•Pichia caribbica 增强 H3K27ac 的富集和乙酰转移酶活性。•由酵母激活的磷脂酰肌醇信号通路可提高梨树的抗病性。•该研究首次揭示了 P. caribbica 的表观遗传生物控制机制。

1. 引言
库尔勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yü）是新疆最具代表性的地理标志产品之一，2019 至 2024 年期间，在中国新疆巴音戈林蒙古自治州的种植面积保持稳定，超过 400 平方公里（Fu 等，2026）。香梨的黑头病（也称为“顶腐病”或“萼端黑斑病”）主要由采后储存期间感染链格孢菌（Alternaria）引起。在疾病晚期，受感染的组织会坏死，并产生黑色菌丝和渗出物（Ouyang 等，2021）。在分子水平上，黑头病会破坏活性氧（ROS）的平衡、苯丙素代谢、氧化还原蛋白质谱型和激素信号网络（Sun 等，2023）。具体来说，链格孢菌会导致库尔勒香梨中丙二醛（MDA）和 H2O2 的积累，增加脂氧合酶（LOX）的活性，并降低果实的抗性（Yang 等，2024）。黑头病感染果实在不同储存阶段的木质素含量、木质素单体和关键酶活性会影响疾病的进展（T. Sun 等，2025）。目前管理库尔勒香梨黑头病的策略包括物理、化学和生物方法。物理处理如 UV-C 辐照可通过增强防御相关酶活性和酚类代谢物的水平来提高抗性（Sun 等，2022）。葡萄籽多酚这种天然化合物可以提升抗氧化酶的活性和苯丙素代谢途径，从而提高库尔勒香梨对黑头病的抗性（P. Sun 等，2025）。对于生物控制，已证明枯草芽孢杆菌 Y2 可以诱导对由油菜链格孢菌（Alternaria brassicicola）引起的黑斑病的抗性（Wang 等，2023）。然而，库尔勒香梨黑头病的生物控制仍然有限；因此，探索有效的生物控制策略及其机制对于管理该病害至关重要。

拮抗酵母是一种有前景的果树和蔬菜采后病害生物控制策略，主要通过复杂的防御信号通路诱导宿主的全身抗性（Chen 等，2023）。这种诱导的抗性表现为防御相关酶（几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、过氧化物酶和苯丙氨酸氨裂解酶）活性的增强以及抗菌代谢物的积累增加（Zheng 等，2023）。在拮抗酵母中，Pichia caribbica 被证明是一种安全有效的生物控制剂，对多种采后病害具有广谱活性。先前的研究表明，P. caribbica 处理可以显著降低苹果中的青霉菌腐烂（Q. Yang 等，2020）和桃树中的立枯丝核菌腐烂（Xu 等，2013）。在樱桃番茄中，P. caribbica 可以触发有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）、Ca2? 和植物激素信号通路，上调 ROS 清除和防御相关基因，并通过激活次生代谢促进总酚类、木质素和黄酮类物质的积累，从而提高对炭疽病的抗性（Zhang 等，2022）。这些由酵母诱导的防御反应由复杂的细胞内信号通路协调，包括通过识别微生物相关分子模式（MAMPs）和损伤相关分子模式（DAMPs）触发的磷脂信号通路（Kong 等，2024）。磷脂酰肌醇代谢途径作为磷脂信号通路的关键分支，通过磷脂酶 C（PLC）生成第二信使来调节防御反应（Lu 等，2025）。虽然该通路已被证明可以增强采后葡萄的抗病性（Zhu 等，2025），但其在库尔勒香梨黑头病抗性中的作用仍不明确。虽然多组学研究已经发现了植物中富集的磷脂酰肌醇信号通路（Singh 等，2023），但从组蛋白乙酰化修饰的角度进行的探究仍然较少。翻译后蛋白质修饰调节植物广泛的生理和生化过程，包括通过激素信号进行的生长和发育、应激反应以及代谢酶活性（Wang 等，2021）。其中，组蛋白乙酰化是一种普遍存在的、动态的、可逆的修饰，主要发生在组蛋白 H3 和 H4 的赖氨酸残基上（Qi 等，2025）。通过诱导染色质松弛，高水平的组蛋白乙酰化有助于转录因子接触顺式调控元件，从而促进目标基因的转录并调节多种过程，如信号通路活性、细胞代谢和防御反应（Zhang 等，2024）。在生物和非生物胁迫下，组蛋白乙酰转移酶（HATs）和组蛋白去乙酰化酶（HDACs）之间的动态平衡使植物能够适应环境。在植物免疫研究中，拟南芥中的 HOS15-HDA9 复合物通过降低 H3K9 乙酰化来抑制 NLR 基因的转录，从而负调节免疫反应（L. Yang 等，2020）。在小麦中，PLATZ5 与 TaHAG1 交互作用，通过 H3K14 乙酰化增强 TaPAD4 的表达，从而提高对白粉病的抗性（Song 等，2022）。在木薯中，MeHAM1 通过促进 H3K9 和 H4K5 乙酰化激活水杨酸（SA）生物合成基因，从而提高抗病性（Zhao 等，2023）。然而，在果树中，组蛋白乙酰化研究主要集中在成熟和冷胁迫响应上，包括香蕉（Song 等，2019，Xie 等，2026）、苹果（Hu 等，2022）和番茄（Deng 等，2022，Zhou 等，2024），对病害抗性机制的研究相对较少。植物组蛋白乙酰化研究主要集中在田间作物免疫或果实成熟和冷胁迫上，很少涉及采后病害抗性或组蛋白乙酰化在生物控制诱导的抗性中的作用。因此，库尔勒香梨采后黑头病抗性的表观遗传机制尚不明确。

本研究的初步实验发现，P. caribbica 可以在整个储存期间显著抑制库尔勒香梨的黑头病，而不会对果实品质产生不利影响。此外，已经确定了控制库尔勒香梨黑头病的最佳浓度，为进一步研究其作用机制奠定了基础。在本研究中，我们对经过 P. caribbica 处理的库尔勒香梨和对照组的组蛋白乙酰化模式及转录组进行了比较分析，处理时间为 120 天。目的是研究组蛋白乙酰化在库尔勒香梨抗病性中的复杂作用，强调磷脂酰肌醇信号通路在梨树抗黑头病中的作用，并为果实抗病性的表观遗传修饰建立理论基础。

2. 材料与方法
2.1. 库尔勒香梨、拮抗酵母和病原微生物
库尔勒香梨（Pyrus sinkiangensis Yü）是从中国库尔勒的一家本地储存和保鲜企业获得的。为了确保实验的可重复性和一致性，选择了大小一致、无机械损伤且未经任何商业采后处理的果实进行研究。Pichia caribbica 来自中国北京的中国普通微生物菌种保藏中心（CGMCC）。冻干的 P. caribbica 粉剂在中国青岛 Hope Bio-Technology Co., Ltd. 进行活化，并在 YPD 培养基上稳定传代培养两次；长期保存采用甘油冷冻保存，短期储存则在 4°C 的斜面培养基上进行。实验使用前，将酵母细胞浓度调整为 1 × 10? 细胞/mL。导致库尔勒香梨黑头病的 Alternaria tenuissima 是在我们的实验室中分离和纯化的。根据实际采后生产条件，将 A. tenuissima 调整为工作浓度 1 × 10? 细胞/mL。

2.2. 果实处理
使用无菌软木钻在每个梨果的萼端制作均匀的伤口（3 mm × 3 mm）。对于处理组（PcAt），在室温下将 15 μL 的 P. caribcica 细胞悬浮液（1 × 10? 细胞/mL）注入每个伤口。空气干燥 2 小时以允许酵母定殖后，将等体积的 A. tenuissima 孢子悬浮液（1 × 10? 细胞/mL）注入同一伤口。在室温下适应 2 小时后，所有处理过的果实都储存在 -1.5°C、相对湿度为 90%-95% 的冷藏室中 180 天。每隔 30 天监测一次病害发生率，并记录每个果实萼端的病灶直径。对照组（At）用无菌生理盐水处理，而不是 P. caribcica 细胞悬浮液。PcAt 和 At 处理各有 3 个生物重复，每个重复包含 12 个梨果。

2.3. 染色质免疫沉淀（ChIP）
由于 H3K27ac 是活性增强子和启动子的特征性标记物，并在植物应激反应和转录调节中起关键作用（Du 等，2013），我们选择这种组蛋白修饰进行染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）分析。PcAt 和 At 组都进行了 ChIP-seq 分析。每个样本包含两部分：输入对照和免疫沉淀（IP）部分。输入对照由未经过免疫沉淀的超声破碎的基因组 DNA 组成；相反，它直接进行反交联、纯化并进行分析。用 H3K27ac 抗体进行免疫沉淀的样本被称为 IP 组，代表特异性富集了 H3K27ac 修饰的染色质片段。根据 P. caribcica 的效果，选择了处于疾病发展中期（120 天）的库尔勒香梨进行 ChIP 分析。PcAt 和 At 的 ChIP 实验各有 2 个生物重复。ChIP 由 Corebiolab Co., Ltd.（武汉，中国）完成。所有操作都在冰上进行，所有试剂和仪器都提前预冷以保持染色质的完整性。将储存 120 天的库尔勒香梨果肉样本（每个样本 2-4 克）切成小块，浸入含甲醛的交联缓冲液中，真空处理 15-30 分钟；加入甘氨酸终止交联（5 分钟真空处理），然后洗涤、擦干表面水分，并在液氮中研磨成粉。将粉末用提取缓冲液 I 溶解（在冰上孵育 30 分钟），通过双层 Miracloth 过滤布过滤，然后依次离心（6000 rpm，4°C，20 分钟；12000 rpm，4°C，5 分钟）以去除上清液。沉淀物用提取缓冲液 III 重新悬浮，并进行密度梯度离心（13000 rpm，4°C，1 小时）以富集染色质，然后将其用核酸裂解缓冲液裂解（在冰上孵育 30 分钟）。在染色质片段化之前，保留每个样本的 20 μL 作为对照。染色质片段化使用 Bioruptor 非接触式超声破碎仪进行，通过琼脂糖凝胶电泳验证片段大小以满足实验要求。预洗的 Protein G 篮子与 ChIP 级别的 H3K27ac 抗体（目录号：ab4729，品牌：Abcam）在 4°C 下孵育 4-12 小时以形成复合物，然后将复合物与片段化的染色质混合并在 4°C 下孵育 7-12 小时以实现特异性结合。洗涤以去除非特异性结合后，将复合物洗脱（800 rpm，65°C，20 分钟），加入 5 M NaCl 进行过夜解交联（600 rpm，65°C）（输入样本也在相同条件下处理），然后用 RNase 和 Proteinase K 消解（45°C，1 小时）。纯化的 DNA 用 15-20 μL ddH2O 洗脱后，用 qubit 4.0 进行定量，储存在 -80°C，经过 Qubit 4.0 和 QSep400 质量检测后，进行文库构建（末端修复、接头连接、PCR 扩增、磁珠纯化），并在 Illumina NovaSeq 6000 平台上进行测序。

2.4. RNA-seq
从 PcAt 和 At 组的库尔勒香梨果肉样本（在 120 天时收集）中提取总 RNA 用于转录组分析。然后由 Corebiolab Co., Ltd.（武汉，中国）在 Illumina NovaSeq 平台上进行高通量 RNA 测序，获得用于后续生物信息学分析的原始测序数据。使用 Fastp 软件（版本 0.20.0）过滤原始测序数据以获得高质量的数据。使用 FeatureCounts 软件（版本 1.6.0）进行转录本定量，计算归一化的基因表达水平，表示为每百万映射读数的转录本片段数（FPKM）。使用 edgeR 识别差异表达基因（DEGs），筛选标准为 |log2 倍变（FC）| > 1 和假发现率（FDR）< 0.05。此外，对鉴定的 DEGs 进行功能富集分析以探索其生物学功能。

2.5. 染色质免疫沉淀和转录组的联合分析
将 ChIP-seq 的峰值相关基因与 RNA-seq 的差异表达基因进行比较，以识别在 ChIP-seq 中显示差异表达的目标基因。对与相关基因的 GO 注释对应的基因以及所有与 KEGG 地图编号对应的基因进行富集分析，根据 qvalue < 0.05 和富集特征 EnrichDirect（Over）筛选显著富集的结果。使用 iTAK 软件版本 1.7a（Zheng 等，2016）识别和分类峰值相关基因的转录因子。**磷酸肌醇信号通路分析**

根据ELISA试剂盒（中国翊和生物技术有限公司）提供的说明书，严格测定了磷酸酸（PA）、肌醇1,4,5-三磷酸（IP3）、磷酸肌醇二磷酸（PI(4,5)P2）、二酰基甘油（DAG）和钙离子的含量，以及磷脂酶C（PLC）和二酰基甘油激酶（DGK）的活性。所有实验均按照试剂盒的协议进行，结果如下：PA以nmol L?1表示；IP3和DAG以ng mL?1表示；PI(4,5)P2和钙离子以pg mL?1表示；PLC以U mL?1表示；DGK以U L?1表示。PLD的活性检测遵循Li等人（2024年）的方法，并进行了轻微修改。PLD的活性以U g?1.2.7表示。

**ChIP-qPCR和药理学抑制试验**

进一步进行了ChIP-qPCR，以定量At和PcAt样品（120天）中关键通路基因启动子峰处的H3K27ac富集情况，使用正常IgG作为阴性对照以排除背景干扰，信号以输入DNA的百分比（%Input）进行归一化，每个组重复三次（中国武汉Corebiolab有限公司）。数据归一化使用公式（1）计算：

(1)%Input = 2 × (????Input ? ????ChIP) × DF × 100

其中CtInput和CtChIP分别代表输入染色质DNA和免疫沉淀DNA的阈值循环数；DF表示输入染色质样本的稀释因子。ChIP-qPCR的特异性引物列于表1中。

**表1. 用于Q-PCR和ChIP-qPCR分析的特异性引物**

| 空细胞 | 基因名称 | 基因ID或访问号 | 正向引物（5′→3′） | 反向引物（5′→3′） |
|-------|-----------|-------------|-------------|-------------|
| 1 PyHHT | 1Psin08 | G004350 | GCCAACCGAAACGACGATGTCATGCGGTCATTGGATGCT | |
| 2 PySMX | L7-like | Psin07 | G016570 | ATATTCGCTCACGACGCACTCGACCCTTCATCGCTATCCG | |
| 3 PyCORYNE | Psin13 | G010230 | TGGATTCGGAGTTTGAGCCGAAACACTCTGGAGCACTGTAGC | |
| 4 未characterized protein | Psin08 | G002290 | AGCCAGGAGCTCAGAGGAATGGTGCTAATTTCCCGGCTGA | |
| 5 PybZI | Psin02 | G013390 | TCCAGCCAATCTTCCCTCTGGGTTGCCTGAAAAAGGTCCG | |
| 6 Pyzf-HD | Psin13 | G005950 | GAGGATTTCTGCAGCGAGGTCCTATGCTGCCGTTTCC | |
| 7 PyKAT6A | Psin15 | G015220 | TATGCAACTACAGCTCCGCCCTTTCCAATTCGCCGGCCTC | |
| 8 PyMYST | Psin08 | G013340 | CGATAGGAACACCGGCGAGCGTTGGCCGAAGGATGGTAT | |
| 9 PyPIP5K | Psin12 | G007230 | TGTGAGAGGTAGCCGACTGAAACGGATTCTCTGCATGG | |
| 10 PyDGK | Psin09 | G007250 | TTATCGACGAAAGGCCCACCCCCGTCGATCCTCATGTACG | |
| 11 PyPLD-α | Psin17 | G016780 | TACACGGATAAGAGCGACATGCCCTAAACTTCCACCAC | |
| 12 PyPLC-δ | Psin07 | G016520 | CGGAGGGACATTGACTACGTGAGCATCTGAGCGACT | |
| 13 PyActin | LOC10 | 3950 | 746AGCAACTGGGATGACATGGATCACCAGGTCCAGCACA | |
| 14 ChIP-qPCR-PyPIP5K | Psin12 | G007230 | CCAAAACCCACCGCACTTGCCCACAAAAGCAAATCAAAGGC | |
| 15 ChIP-qPCR-PyDGK | Psin09 | G007250 | CTCGTTCAAATCGCCGTGTGATCCAAAAGCGCAGAGGG | |

**使用新霉素的药理学抑制试验**

使用新霉素（中国上海悦源生物技术有限公司）进一步进行了药理学抑制试验，新霉素是磷酸肌醇信号级联的特异性抑制剂（Jiao, 2021）。试验分为四组：（1）At；（2）At + 10 μM新霉素；（3）PcAt + 10 μM新霉素；（4）PcAt。每组的库尔勒香梨果实接种后在室温下浸泡在相应的处理溶液中10分钟。自然风干后，所有果实均保存在室温条件下。每个处理组包含6个单独的果实，总共重复三次。浸泡处理后自然风干，所有库尔勒香梨果实均在室温下培养。每隔2天拍摄一次表型照片，并持续测量病斑直径以动态追踪疾病扩展情况。

**2.8. 库尔勒香梨的参考基因组**

库尔勒香梨的参考基因组来自国家生物信息中心（中国基因组库，CNBG）。使用Pyrus sinkiangensis（库尔勒香梨）的染色体级参考基因组作为RNA-seq和ChIP-seq数据分析的通用参考。该基因组由石河子大学于2023年8月发布，可在国家基因组数据中心（NGDC，中国）的基因组库（GWH）中获取，访问号为GWHDTVS00000000（BioProject: PRJCA007928；BioSample: SAMC551314）。

**2.9. RNA提取和qRT-PCR分析**

使用植物RNA提取试剂盒（中国南京Vazyme生物技术有限公司）严格按照制造商的协议提取总RNA。将用液氮研磨的适当量的梨组织立即加入600 μL Buffer EL中，然后剧烈涡旋30秒以确保样本与裂解缓冲液充分混合。通过一系列步骤提取总RNA，包括离心、过滤、洗涤和洗脱。提取后测量RNA浓度；如果符合要求标准，将RNA储存在-80°C以备后续使用。使用HiScript II Q RT SuperMix逆转录试剂盒（中国南京Vazyme生物技术有限公司）严格按照试剂盒协议从总RNA合成第一链cDNA。使用TB Green Premix ExTaq II（中国北京TAKARA）扩增cDNA。PyActin作为内参基因，使用2?ΔΔCt方法计算目标基因的相对表达水平。所有操作均严格遵循相应试剂的说明书。Q-PCR使用的特异性引物列于表1中。

**2.10. 统计分析**

数据使用GraphPad Prism 10可视化，结果表示为平均值±标准差。所有实验每个样本重复三次（n = 3）。ChIP-seq实验每个样本重复两次（n = 2）。使用t检验（?p < 0.05，??p < 0.01）评估每个采样时间点两组之间的显著差异，多重比较使用双向ANOVA和Dunnett检验，每个储存时间点均以At组为对照进行单独分析。

**3. 结果**

**3.1. P. caribbica对库尔勒香梨黑头病的控制效果**

根据PcAt和At组的果实表型，可以观察到P. caribbica对香梨黑头病病斑有显著抑制作用（图1A）。随着储存时间的延长，果实萼片病斑的直径逐渐扩大。在接种初期（30天），两组的病斑都没有变化。从60天开始，At组的病斑开始扩大。在120天、150天和180天时，PcAt组的病斑直径分别比At组低57.8%、66.6%和39.7%（图1B）。基于果实疾病抗性表型，在感染中期（120天）选择了香梨样本进行后续分子实验。

**3.2. 库尔勒香梨的染色质免疫沉淀分析**

**3.2.1. 库尔勒香梨的染色质免疫沉淀结果**

库尔勒香梨果实的染色质免疫沉淀（ChIP）实验系统的验证结果表明该系统有效且可重复。热图分析显示，免疫沉淀（IP）样本在转录起始位点（TSS）附近显示出显著的特异性信号富集。相比之下，输入对照（Input）样本中没有明显的信号富集（图2A-D）。所有样本的相关热图分析（图2E）显示，Input和IP组之间的相关系数显著低于组内相关系数，范围在0.64到0.80之间。这一结果证实了免疫沉淀过程特异性富集了目标染色质片段，并且Input和IP组之间存在显著的表观遗传修饰差异。此外，PcAt和At在TSS上游和下游2 kb区域的H3K27ac修饰峰的分布与典型的组蛋白H3K27ac的基因组分布一致（图2F），进一步验证了实验结果的可靠性。

**3.2.2. 乙酰化峰分布和转录因子预测**

为了进一步探索蛋白质修饰结合位点的特征并阐明基因调控中的蛋白质修饰机制，本研究统计了与每个基因功能元素相关的峰的数量。具体来说，本研究关注PcAt处理后的上调峰。结果显示（图3A），近端启动子区域的峰的总比例为27.19%，包括启动子（0–1 kb）：10.91%，启动子（1–2 kb）：8.48%，启动子（2–3 kb）：7.80%。第一个外显子和第一个内含子的比例较高：First_exon的比例（18.91%）显著高于Other_exon的比例（13.49%），这可能是由于许多基因的第一个外显子长度较短但覆盖范围较广，或者信号偏向转录起始区域。First_intron的比例（9.06%）也高于Other_intron的比例（6.00%），这与“第一个内含子通常较长且富含调控元件”的已知现象一致。基因间区域（Intergenic）的总比例为22.22%，这些差异性乙酰化区域位于已知基因的远端区域。此外，与At相比，PcAt参考基因组中上调差异性乙酰化峰的分布更清晰地反映了它们在整个基因组中的结合偏好。

**3.2.3. GO富集分析**

GO富集结果（图3D）显示，生物过程（BP）包括小蛋白结合或去除引起的蛋白质修饰、小蛋白结合引起的蛋白质修饰、对含嘌呤化合物的反应、收缩肌动蛋白纤维束的组装和伪足回缩。细胞组分（CC）包括液泡膜、液泡部分、肌动蛋白纤维、顶端皮层和吞噬杯基部。分子功能（MF）主要包括泛素样蛋白转移酶活性、泛素-蛋白质转移酶活性、转录共激活剂活性、转录抑制剂活性和14–3–3蛋白结合。这些GO富集结果表明，与上调峰相关的基因主要参与蛋白质修饰、细胞骨架组织、液泡相关结构和转录调控等生物过程。

**3.2.4. KEGG富集分析**

KEGG中有12个显著富集的代谢通路（p值<0.05），从上到下依次为：一般转录因子（General Transcription Factors）、光合生物中的碳固定（Carbon Fixation in Photosynthetic Organisms）、泛素介导的蛋白质裂解（Ubiquitin-Mediated Proteolysis）、磷酸肌醇信号系统（Phosphatidylinositol Signaling System）、光系统天线蛋白（Photosystem Antenna Proteins）、戊糖磷酸途径（Pentose Phosphate Pathway）、苯丙氨酸代谢（Phenylalanine Metabolism）、糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）、蛋白酶体（Proteasome）、丙酮酸代谢（Pyruvate Metabolism）和萜烷/哌啶/吡啶生物碱生物合成（Tropane/Piperidine/Pyridine Alkaloid Biosynthesis）。鉴于磷酸肌醇信号通路作为核心膜近端免疫模块的身份，以及在其关键基因（PyPIP5K、PyDGK）的启动子处标记的H3K27ac富集，该通路被优先进行进一步分析。

**3.3. RNA-seq分析**

**3.3.1. 差异表达基因**

对120天PcAt和At组样本进行log?(FPKM+1)转换后，基因表达水平分布（图4A）显示所有样本的转换表达水平中位数基本相同，表明数据已有效归一化且稳定。热图聚类结果和差异表达基因（DEGs）的层次聚类热图（图4B、C）表明，PcAt组和At组之间的基因表达模式存在显著差异；其中，PcAt组的生物重复样本（PcAt_1/2/3）和At组的生物重复样本（At_1/2/3）紧密聚类，显示出良好的组内再现性且差异较小，两组之间存在明显的分离，这证实了PcAt是导致基因表达差异的核心驱动因素。下载：下载高分辨率图像（552KB）下载：下载全尺寸图像图4。（A）基因表达差异的箱线图。（B）PcAt和At样本之间的相关性分析。（C）PcAt和At样本之间差异表达基因的热图。（D）PcAt和At的主成分分析。（E）差异表达基因的火山图。（F）所有样本在基因功能模块中的分布。（G）RNA-seq GO富集分析。（H）RNA-seq KEGG分析。PCA分析进一步验证了上述结果，PcAt组和At组各自形成了独立的簇（图4D）：At组内样本的相关系数范围为0.986至1.000，PcAt组内样本的相关系数范围也为0.989至1.000，表明两组内的生物重复样本具有一致性；相比之下，PcAt组和At组之间的相关系数显著降低，仅介于0.373至0.396之间，这清楚地表明在两种处理条件下基因表达模式存在显著差异，处理效果可以明显区分。使用假发现率（FDR，Padj）< 0.05和|log?倍数变化（FC）| > 1作为筛选标准，共鉴定出1065个显著差异表达的基因（DEGs），包括234个显著上调基因和831个显著下调基因。这些DEGs的总体分布通过火山图可视化（图4E），直观地展示了两组样本之间的基因表达差异特性。在转录组分析中，基因组被分割为编码序列（CDS）、5′非翻译区（5UTR）、3′非翻译区（3UTR）、内含子和基因间区域，并量化了每个区域的读段比对比例（图4F）。结果表明，RNA-seq测序读段主要集中在CDS区域，这与转录组测序数据的典型分布模式一致，验证了测序结果的可靠性。

3.3.2. 转录组的GO和KEGG富集分析
GO富集分析的结果（图4G）显示，经过PcAt处理后显著上调的差异表达基因（DEGs）主要富集在氧化还原过程（生物过程）和相关氧化还原酶活性中，表明活性氧代谢的重编程和氧化还原稳态在香梨果的抗病反应中起着关键作用。这一结果与KEGG通路富集结果一致，即苯丙烷类物质代谢和激素信号传导，共同揭示了P. caribbica可以通过协调调节氧化还原稳态、防御相关酶活性和细胞器功能来系统地激活香梨果的免疫和代谢防御网络。KEGG富集分析显示（图4H），在香梨果中显著上调的差异表达基因（DEGs）主要富集在三类生物过程中，即植物激素信号转导、苯丙烷类物质和次级代谢物的生物合成以及脂肪酸衍生物和氧化还原代谢。这表明，在P. caribbica的作用下，香梨果形成了一个协调的调节网络，覆盖信号相互作用、关键防御代谢物（苯丙烷类物质、黄酮类）的合成以及氧化还原稳态的维持。

3.4. ChIP-seq & RNA-seq分析
3.4.1. 组蛋白乙酰化修饰与转录组的综合分析
组蛋白乙酰化修饰与转录组数据的联合分析显示（图5A、B），H3K27ac是活跃增强子和启动子的特异性标志物。在这项研究中，我们重点识别了在ChIP-seq和RNA-seq数据中均显著上调且在ChIP-seq的启动子区域富集的关键候选基因。在ChIP-seq上调基因和转录组中显著上调的差异表达基因（DEGs）中，共有49个基因是共同的，包括4个防御相关基因。这4个基因的ChIP-seq峰值都位于启动子区域，具体为：未表征蛋白（Psin08G002290）、PyHHT1（Psin08G004350）、PySMXL 7样（Psin07G016570）和PyCORYNE（Psin13G010230）。
下载：下载高分辨率图像（365KB）下载：下载全尺寸图像图5. ChIP-seq和RNA-seq的综合分析。（A、B）ChIP-seq和RNA-seq的维恩图分析。（C）在ChIP-seq和RNA-seq中同时上调的基因的GO富集分析。（D）在ChIP-seq和RNA-seq中同时上调的基因的信号通路富集分析。（E）显著上调转录因子的分析。
对转录组数据中组蛋白乙酰化相关酶的分析显示，PcAt处理组中香梨 histone去乙酰酶的表达显著抑制，而组蛋白乙酰转移酶显著活化。基于这些发现，本研究重点关注组蛋白乙酰转移酶，并鉴定出两个具有显著表达趋势的梨类乙酰转移酶以验证其表达水平：PyKAT6A（Psin15G015220）和PyMYST（Psin15G029020）。
联合分析还识别出四个候选转录因子（图5E），其中HSF属于热休克因子家族；bZIP转录因子在高等植物中构成一个庞大且保守的家族，在植物对生物和非生物胁迫（如低温、干旱、盐度以及病虫害）的响应中起关键调节作用；zf-HD转录因子参与种子发育和对生物和非生物胁迫的响应；HB-HD-ZIP转录因子主要调节植物生长和发育。本研究重点验证这两个转录因子bZIP和zf-HD。

3.4.2. 结合ChIP-seq和RNA-seq的GO和KEGG富集分析
GO富集分析（图5C）显示，这些基因在生物过程中显著富集，包括种子休眠、细胞周期、DNA复制调控和液泡跨膜运输；细胞成分，包括高尔基体膜和修复复合体；以及分子功能，包括氧化还原酶和转运蛋白。KEGG通路分析（图5D）进一步显示，这些基因显著富集的代谢途径包括：其他糖苷酸降解（p值=0.0184）、角质素、木脂素和蜡的生物合成（p值=0.0312）、类胡萝卜素生物合成（p值=0.0419）和氮代谢（p值=0.0472）。

3.4.3. 关键基因相对表达水平的验证
对四个候选防御基因的定量验证显示，未表征蛋白（一种在中国梨中功能未知的蛋白质）的表达模式在储存期间先增加后减少（图6A）。在60天和120天时表达显著上调（p<0.05），在60天时达到相对峰值。PyHHT1基因在早期储存期间表达略有下降（图6B）。在90天和120天时表达逐渐增加，并显著高于At组（p<0.05），在120天时达到峰值；到储存结束时（150天和180天），其表达水平降至最低。PySMXL 7样基因的表达最初增加，随后减少（图6C），在90天和120天时其表达水平显著高于对照组（p<0.05）。在早期储存期间，PcAt组和At组中的PyCORYNE基因表达水平均低于初始水平（图6D）；随着储存时间的延长，At组的表达呈波动下降趋势，而PcAt组则表现出先上升后下降的趋势；此外，在60天到150天期间，PcAt组的表达水平显著高于At组（p<0.01）。
下载：下载高分辨率图像（500KB）下载：下载全尺寸图像图6. 综合分析识别的候选基因的相对表达水平分析：（A）未表征蛋白，（B）PyHHT1，（C）PySMXL 7样，（D）PyCORYNE，（E）PybZIP转录因子，（F）Pyzf-HD转录因子，（G）乙酰转移酶基因PyKAT6A，（H）乙酰转移酶基因PyMYST。
转录组数据中组蛋白乙酰化相关酶的分析显示，PcAt处理组中香梨 histone去乙酰酶的表达显著抑制，而组蛋白乙酰转移酶显著活化。基于这些发现，本研究重点关注组蛋白乙酰转移酶，并鉴定了两个具有显著表达趋势的梨类乙酰转移酶以验证其表达水平：PyKAT6A（Psin15G015220）和PyMYST（Psin15G029020）。
联合分析还识别出四个候选转录因子（图5E），其中HSF属于热休克因子家族；bZIP转录因子在高等植物中构成一个庞大且保守的家族，在植物对生物和非生物胁迫（如低温、干旱、盐度和病虫害）的响应中起关键调节作用；zf-HD转录因子参与种子发育和对生物和非生物胁迫的响应；HB-HD-ZIP转录因子主要调节植物生长和发育。本研究重点验证这两个转录因子bZIP和zf-HD。

3.5. 磷脂酰肌醇信号系统分析
在磷脂酰肌醇信号通路中，At组的PLD活性高于PcAt组（图7B）。在120天时，At组的PLD活性达到1.03 U g^-1，比PcAt组高46.7%（p<0.05）。At组表现出整体波动趋势，而PcAt组表现出下降趋势。相比之下，磷脂酶C（PLC）活性在PcAt组中始终高于At组（图7A），两组都表现出先增加后下降的总体趋势。PcAt组在90天时活性达到最高值25.21 U mL^-1，显著高于At组（p<0.01）。随后，PLC活性开始下降，但在120天和150天时PcAt组仍显著高于At组（p<0.05）。
下载：下载高分辨率图像（701KB）下载：下载全尺寸图像图7. PcAt对磷脂酰肌醇信号的影响。（A）磷脂酶C。（B）磷脂酶D。（C）PIP2。（D）二酰甘油激酶。（E）PyPLCδ的相对表达。（F）PyPLDα的相对表达。（G）PyPIP5K的相对表达。（H）PyDGK的相对表达。（I）二酰甘油含量。（J）磷酸肌醇三磷酸含量。
二酰甘油激酶（DGK）是PLC通路中的关键酶，其主要功能是将二酰甘油（DAG）转化为功能性磷酸脂（PA）。在整个储存期间，DGK活性下降（图7D）。然而，从30天到120天，PcAt组的DGK活性显著高于对照组（p<0.01），在90天时达到940.63 U L^-1的峰值。二酰甘油（DAG）含量先增加后下降（图7I）。在磷脂酰肌醇信号通路中，其在90天、120天和150天的含量显著高于对照组（p<0.01），相应的DGK活性也显著高于对照组（图7D）。香梨果实中的磷脂酰肌醇（4,5）-二磷酸（PIP2）含量在果实疾病防御过程中显著高于对照组（图7C）。在磷脂酰肌醇信号通路中，PLC水解PIP2产生肌醇三磷酸（IP3），后者释放到细胞质中，同时产生二酰甘油（DAG）。香梨果实中的IP3含量呈现波动变化（图7K），在30天、120天和150天时显著高于对照组（p<0.05）。IP3调节钙离子浓度，促进信号转导。香梨果实中的Ca2+浓度先增加后下降（图7K）。PGK的浓度也呈现上升趋势（图7J），在60天到180天时显著高于对照组（p<0.05）。磷酸肌醇4-磷酸（PIP5K）在肌醇环的D5位置催化PI4P的磷酸化，形成PIP2，这是PIP2合成的限速步骤。在储存的中后期（90-180天），其表达水平高于对照组（图7G），从而促进了PLC反应底物的积累。PLCδ和PLDα分别是PLC家族和PLD家族的亚型。转录组数据显示，120天时PyPLCδ和PyPLDα的表达水平高于对照组。进一步验证表明，这两个基因在PcAt诱导后30天内显著表达（p<0.05，图7E, F），随后表达迅速下降。3.6. PLC抑制剂测定和PyPIP5K及PyDGK的ChIP-qPCR分析结果显示，在Korla香水梨上进行的PLC新霉素测定显示，At处理组和At+新霉素处理组在储存2天后出现了病变，而PcAt+新霉素处理组则在储存4天后首次出现病变（图8A）。在整个实验过程中，PcAt组的病变面积保持较小。尽管随着储存时间的延长病变面积逐渐扩大，但PcAt处理的病变始终比其他处理组小。与视觉观察结果一致，病变直径的测量显示，在储存4天、6天和8天时，PcAt组的病变直径明显小于其他三个组（p<0.05，图8B）。对两个核心磷脂酰肌醇信号基因PyPIP5K和PyDGK在120天时的ChIP-qPCR分析显示，PcAt处理显著增加了这两个基因位点的H3K27ac富集（p<0.01）。IgG阴性对照仅产生极低的背景信号，表明PcAt促进了两个靶基因区域的组蛋白乙酰化（图8C, D）。下载：下载高分辨率图像（482KB）下载：下载全尺寸图像图8. PLC抑制剂测定和PyPIP5K及PyDGK的ChIP-qPCR结果。（A）储存0-10天期间用磷脂酶C抑制剂（新霉素）处理的Korla香水梨的表型观察。（B）抑制剂处理下Korla香水梨的病变直径。（C）储存120天后果实中PyPIP5K的ChIP-qPCR结果。（D）储存120天后果实中PyDGK的ChIP-qPCR结果。4. 讨论Korla香水梨的黑头病严重影响了采后果实品质，导致显著损失。接种A. tenuissima的Korla香水梨缺乏足够的先天抗病性，而P. caribbica可以限制梨病斑的扩展，提供保护并削弱A. tenuissima的致病性（图1A）。在疾病发作高峰期（120天）对PcAt处理过的梨进行ChIP-seq和转录组分析显示，PcAt处理显著增加了果实中组蛋白H3K27ac的富集水平（图2G）。转录组分析证实，PcAt激活了梨中的乙酰转移酶，表明PcAt通常增强了组蛋白乙酰转移酶的活性，从而促进了乙酰化修饰。在这些乙酰转移酶基因中，PyKAT6A（Psin15G015220）和PyMYST（Psin15G029020）在储存期间显著表达（图6G, H）。组蛋白乙酰转移酶（HATs）的激活增加了植物中的组蛋白乙酰化，从而促进了防御基因的表达（Wang等人，2024年）。Q-PCR分析证实，两种转录因子PybZIP和Pyzf-HD（图6E, F）以及三种与防御相关的候选基因PyHHT1、PySMLX7-like和PyCORYNE的表达水平均上调（图6B, C, D）。PyHHT1是一种BAHD家族的酰基转移酶，是角质层、木脂素和蜡生物合成的关键酶（Chandrakanth等人，2023年）。其上调表明P. caribbica可能通过促进角质层屏障的形成来增强果实的抗病性，这与先前报道的Bacillus subtilis诱导香水梨中的HHT1表达以赋予抗黑斑病能力的研究一致（Wang等人，2023年）。PySMXL7-like属于SMAX1-LIKE蛋白家族，该家族负调控参与植物生长和应激反应的独脚金内酯和karrikin信号通路（Feng等人，2023年）。SMXL蛋白也被发现与苹果的抗逆性有关（Zhang等人，2025年），表明它们在抗逆性调节中具有保守作用。PyCORYNE编码一种富含亮氨酸的重复序列受体样伪激酶，通过蛋白质-蛋白质相互作用参与免疫信号转导（Pan等人，2016年）。在普通豆类中，激酶KTR2/3作为非典型的抗病基因，通过“诱饵”模型被NLR蛋白监测，介导对Colletotrichum lindemuthianum的抗性，为植物-真菌相互作用中的激酶功能提供了重要例证（Richard等人，2021年）。值得注意的是，PyCORYNE和磷脂酰肌醇信号通路都在质膜上发挥作用，表明受体激酶信号传导和磷脂信号传导在调节果实抗病性方面可能存在相互作用。PcAt在Korla香水梨中长期抗黑头病的作用与其果实内的信号通路密切相关。作为植物先天免疫系统的核心调控模块，植物磷酸肌醇信号通路的代谢物作为第二信使或膜定位的信号分子，在多种生理过程中起调节作用，包括病原体识别、防御信号转导和抗病反应的执行（Abd-El-Haliem & Joosten，2017年）。ChIP-seq分析显示磷酸肌醇信号通路显著富集。对差异乙酰化区域和差异表达基因的进一步分析表明，PyPIP5K、PyDGK、PyPLCδ和PyPLDα与磷酸肌醇信号通路相关。特别是，ChIP-qPCR结果进一步证实PcAt在120天时提高了PyPIP5K和PyDGK的H3K27ac水平（图8C, D）。储存过程中PyPIP5K和PyDGK的相对表达水平显著升高（图7G, H）。这些结果表明，组蛋白乙酰化可能通过转录因子（bZIP/zf-HD）介导的乙酰转移酶复合体（KAT6A/MYST）的招募促进了这些磷酸肌醇通路基因的转录激活。PyPLCδ和PyPLDα的表达在储存后30天就已短暂上调（图7E, F），表明P. caribbica处理迅速激活了磷酸肌醇通路。这种早期的转录反应发生在120天测量的H3K27ac变化之前，表明最初的通路激活可能是由预先存在的信号成分介导的，而后期持续的H3K27ac富集可能有助于维持激活的转录状态。PcAt处理组中的磷脂酶C（PLC）活性显著高于At对照组（图7A）。相比之下，磷脂酶D（PLD）活性显著低于At对照组（图7B）。尽管PcAt处理组中的PLD酶活性总体受到显著抑制，但转录组数据和相对表达分析证实PLD家族亚型PLDα参与了磷酸肌醇信号通路的调节。这种差异表明，香水梨果实中磷酸肌醇信号通路的调节主要依赖于PLC介导的机制。研究表明，PLC在植物免疫中起作用；在香蕉中，PLC活性及其水解产物IP3和DAG的增强提高了对炭疽病的抗性（Shuai等人，2020年）；在番茄中，SlPLC4特异性介导Cf-4/Avr4诱导的超敏反应（HR）和对Phytophthora的抗性；尽管SlPLC6不直接影响HR，但它对Cf-4、Ve1和Pto/Prf介导的多重抗性机制是必需的，表明PLC在多种抗性蛋白的信号通路中起共同作用（Vossen等人，2010年）；在拟南芥中，PLC2调节早期免疫事件，如活性氧（ROS）的产生、愈伤组织的形成和气孔关闭（D’Ambrosio等人，2017年）。PLC的底物磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP?）由PIP5K催化的磷脂酰肌醇4-磷酸（PI4P）水解生成。PcAt处理显著增加了果实中PyPIP5K基因的相对表达，这与PIP?水平的动态变化一致（图7C）。在PLC的特定水解作用下，PIP?在果实中生成二酰基甘油（DAG）和肌醇三磷酸（IP?）。值得注意的是，PcAt处理组在120天和150天时的DAG积累水平显著高于At对照组（图7I）。DGK可以水解DAG形成磷脂酸（PA），后者与呼吸爆发氧化酶同源物（Rbohs）等特定蛋白质结合，调节活性氧（ROS）的产生——这是植物先天免疫反应的关键步骤（Li & Wang，2019年）；120天和150天时，PcAt组的IP?和钙离子水平高于At组（图7K, L）。IP?的产生是触发钙信号通路的关键调节节点；它从质膜扩散到细胞质基质，在内质网等细胞内钙储存器的膜上特异性结合，从而诱导钙储存器的通道开放并激活下游钙信号通路（Deng等人，2019年）。抑制剂测定进一步验证了磷酸肌醇信号在Korla香水梨抗病性中的调节作用（图8A）。总之，磷酸肌醇信号通路与H3K27ac乙酰化相关，在P. caribbica诱导的Korla香水梨抗病性中起关键作用。这些发现建立了表观遗传修饰与磷酸肌醇信号在采后果实免疫之间的潜在联系。5. 结论P. caribbica能够控制由A. tenuissima引起的Korla香水梨的采后黑头病，表现出显著的抑制病变直径的效果和独特的抗病表型。P. caribbica处理显著改变了梨果实内的组蛋白乙酰化水平，增加了PyPIP5K和PyDGK的乙酰化和转录水平。此外，磷脂信号分子如PIP2、PA和IP3的含量增加，促进了磷酸肌醇信号通路。同时，香水梨果实中多个防御基因——PyHHT1、PyCORYNE和PySMXL7-like的表达与两个潜在的转录因子PybZIP和Pyzf-HD相关，初步鉴定出两种香水梨组蛋白乙酰转移酶。基于这些发现，提出了一个初步模型，即P. caribbica影响梨内的组蛋白乙酰化修饰，调节磷酸肌醇信号通路，从而增强梨对采后黑头病的抗性（图9）。本研究的结果为理解P. caribbica如何控制Korla香水梨的黑头病提供了宝贵的基础。此外，本研究仅在疾病进展的120天时检测了H3K27ac；需要进一步探索P. caribbica作用下的组蛋白乙酰化的动态变化。此外，香水梨果实中组蛋白乙酰化的调节机制仍需进一步研究。已鉴定防御基因、组蛋白乙酰转移酶和转录因子之间的具体相互作用机制尚不清楚，这是未来研究的主要方向。深入的后续研究有望增进我们对香水梨果实采后品质的表观遗传机制的理解，从而增强其抗病性。下载：下载高分辨率图像（472KB）下载：下载全尺寸图像图9. 提出的P. caribbica诱导Korla香水梨黑头病抗性的分子机制。（由Figdraw创建）。示意图展示了PcAt处理后Korla香水梨抗黑头病的信号级联反应。膜识别事件将应激信号传递到细胞核，驱动组蛋白乙酰化的动态变化，促进染色质松弛和目标基因的转录增强。具体来说，H3K27ac水平的升高与磷酸肌醇通路基因PyPIP5K和PyDGK的转录上调相关；它们丰富的蛋白质产物可能重塑磷酸肌醇信号并触发PA和钙第二信使的产生，与果实防御反应相关。四个防御基因启动了独立的下游免疫级联反应，LRR相关蛋白可能在CORYNE下游发挥作用。这些多重信号层的协调共同增强了梨果实对黑头病的抗性。CRediT作者贡献声明Wang Xiaobin：调查；Chen Haixin：写作-审阅与编辑、写作-初稿、方法学、调查、数据管理；Zhang Manman：验证；Wang Jing：写作-审阅与编辑、监督、资金获取；Tian Ziyu：可视化；Wang Wenhui：调查；Gao Zhongchuan：写作-审阅与编辑；Chen Xiaojie：数据管理。