开发易于制备、低成本、稳定且具有优异化学和热稳定性的ZIF-67@酶生物催化剂

《Process Biochemistry》：Development of easy-to-prepare, low-cost, stable, excellent chemical and thermal stabilities ZIF-67@enzyme biocatalysts

　　

摘要

金属有机框架（MOFs）是一类三维杂化材料，因其高比表面积、均匀分布的金属离子以及优异的化学-热稳定性而受到广泛关注。沸石咪唑酯骨架材料（ZIFs）是MOFs中不可或缺的子类。猪胰腺脂肪酶（PPL）因其成本较低且手性选择性优良，在生物催化中被频繁使用。然而，其稳定性差且难以重复使用，限制了其工业应用。为克服这些缺点、增强耐久性并开发稳健的生物催化剂，将酶固定化在固体载体上是一项突出技术。本研究合成了基于钴的ZIF-67，并首次通过吸附和包封两种方法将PPL固定化。包封型ZIF-67@PPLenc的酶活性比吸附型ZIF-67@PPLads高3.0倍。研究了ZIF-67、ZIF-67@PPLads和ZIF-67@PPLenc的形貌结构和孔径。在表征之后，测定了pH值、热稳定性、可重复使用性及动力学参数。值得注意的是，ZIF-67@PPLads和ZIF-67@PPLenc在第五次使用后就分别保留了约61%和77%的活性。本研究表明，ZIF@酶复合材料在稳定性、选择性和可重复使用性方面表现出前所未有的催化性能，这归功于高度有序框架对酶的保护作用。

引言

金属有机框架（MOFs），也称为多孔配位聚合物，是由金属节点或簇与有机配体之间通过配位键组成的一类纳米多孔材料[1]。MOFs是具有可调节结构和可控功能的配位化合物[2]。作为催化的活性位点，构成结构的有机配体提供了丰富的官能团用于化学修饰以及电学[3]、[4]、[5]。沸石咪唑酯骨架材料（ZIFs）是MOFs中多孔结晶的一类子类，其中咪唑醇及其衍生物作为有机配体，锌或钴离子位于活性中心，呈四面体配位，拓扑结构类似于沸石拓扑结构，应用于各种领域[6]、[7]、[8]、[9]。与其他MOFs相比，ZIFs具有更高的稳定性，具有出色的机械稳定性和化学稳定性，其结构也更加灵活[10]、[11]、[12]。

ZIF-67是一种含有Co²⁺离子和咪唑结构的ZIF类型[13]。由于ZIF-67具有半稳定的配位键，ZIF-67可以通过离子交换、配体交换或化学刻蚀反应被其他物质容易地功能化。凭借其独特的性质，如微孔性、结晶性、大比表面积、丰富的结构多样性和出色的热稳定性和化学稳定性，它在酶固定化方面也被认为具有很大的前景[14]、[15]、[16]、[17]、[18]。

鉴于脂肪酶具有选择性好、在各种反应中稳定性优异以及催化无数事件的能力，脂肪酶是生物催化中使用最广泛的酶。猪胰腺脂肪酶（PPL）是一种常用的工业酶，因为其与其他脂肪酶物种相比成本更低且具有生物催化性能。然而，由于其稳定性差且难以重复使用，其在各种工业应用中的活性受到限制。为了克服这些缺点、提高酶的稳定性并开发一种强大的生物催化剂，将固定化技术应用于固体载体已成为一种突出的方法[19]、[20]。

计划通过固定化方法来提高酶的活性、亲和力、选择性和稳定性，并拓展其在更广泛工业领域的应用。结合ZIFs的独特性质，ZIF@酶复合材料由于高度有序的笼状结构对酶的保护作用，被认为在稳定性（温度、化学和pH稳定性）、选择性、储存稳定性和可重复使用性方面表现出前所未有的催化性能。由于ZIF@酶之间良好的相互作用、高酶-底物比以及在水中更好的耐久性和稳定性，ZIFs被认为是酶固定化的有前景的候选材料[21]。

在本研究中，合成了一种基于钴的ZIF种类ZIF-67。首次使用吸附和包封两种不同的固定化方法将合成的ZIF-67固定化猪胰腺脂肪酶（PPL）。研究了ZIF-67、ZIF-67@PPL_ads和ZIF-67@PPL_enc的形貌结构和孔径。在制备的生物催化剂表征之后，研究了pH值、热稳定性和可重复使用性，并测定了动力学参数。

章节摘要

材料

猪胰腺脂肪酶（E.C.3.1.1.3，PPL）、p-硝基苯基棕榈酸酯（p-NPP）、Bradford试剂、碳酸钠、磷酸二氢钾（KH₂PO4）（Merck）、六水合硝酸钴、2-甲基咪唑（2-mIM）均购自Merck或Sigma。

ZIF-67的合成

将六水合硝酸钴（Co(NO₃)₂·6H₂O）（0.54 M，2 mL）溶液加入2-甲基咪唑（2-mIM）水溶液（3.8 M，5 mL）中，然后搅拌1小时。反应混合物在室温下放置过夜。随后将混合物

结果与讨论

在本研究中，合成了一种基于钴的ZIF种类ZIF-67，并首次使用两种不同的固定化方法——吸附法和包封法——将合成的ZIF-67固定化猪胰腺脂肪酶（PPL）。

结论

在本研究中，成功合成了一种MOFs类型材料ZIF-67。通过两种不同的固定化方法（吸附和包封）将合成的ZIF-67固定化猪胰腺脂肪酶（PPL）。ZIF-67@PPL_ads、ZIF-67@PPL_enc和游离PPL的脂肪酶活性分别为20、31和4 U/g。在120分钟结束时，观察到游离PPL仅能保持25%的活性。当ZIF-67和吸附技术作为酶的载体材料时

CRediT作者贡献声明

Elif Ozyilmaz：撰写——初稿、验证、监督。Sebahat Ozdemir：撰写——审阅与编辑、资源、方法论、调查研究。

利益冲突声明

作者声明不存在已知的可能影响本文所报告工作的竞争性经济利益或个人关系。

致谢

感谢土耳其科尼亚塞吕克大学科学研究基金会（SUBAP资助编号21211010）对本研究工作的资金支持。

利益冲突声明

作者声明不存在可能对本论文所呈现研究产生影响的已知财务或人际利益冲突。

Elif Ozyilmaz|Sebahat Ozdemir

塞吕克大学生物化学系，土耳其科尼亚 42075