《Small Methods》：Proximity Proteomics Maps Candidate Cellular Uptake Pathways for Cell-Derived Nanovesicles
编辑推荐：
尽管细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）能够介导细胞间的选择性分子交换，但其低产量和固有异质性限制了转化应用。通过机械挤压供体细胞产生的细胞源性纳米囊泡（cell-derived nanovesicles，CDNs）提供了一种可扩
尽管细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）能够介导细胞间的选择性分子交换，但其低产量和固有异质性限制了转化应用。通过机械挤压供体细胞产生的细胞源性纳米囊泡（cell-derived nanovesicles，CDNs）提供了一种可扩展的替代方案，同时保留了EVs的关键膜特征。然而，制备过程如何重塑囊泡与细胞之间的通讯仍知之甚少。本研究将囊泡侧蛋白质组学与受体细胞蛋白的TurboID邻近标记相结合，构建了CDNs和小细胞外囊泡（small extracellular vesicles，sEVs）相互作用的定量双侧面图谱。尽管尺寸和表面电荷相似，CDNs表现出显著更多样化的蛋白质组以及更广泛的预测摄取相关特征谱。受体细胞邻近蛋白质组学进一步解析出不同的分子群组。CDN相关群组包含受体来源的CALR和NCL，分别与LRP1/CD91相关的胞葬识别和NCL相关的巨胞饮过程存在文献关联；而sEV相关群组则包含与HSPG辅助锚定及网格蛋白介导或CLIC/GEEC相关摄取一致的签名。综合来看，这些互补的数据集揭示了机械挤压产生的CDNs与天然分泌的sEVs具有不同的分子界面。受体依赖性以及表面结合和内化的贡献仍需直接验证；然而，所确定的关联为后续研究定义了具体的机制靶点。这种双侧面蛋白质组学策略为解析囊泡-细胞通讯和工程化膜基纳米载体建立了一个定量框架。
**论文解读：双侧面蛋白质组学揭示细胞源性纳米囊泡的候选摄取机制**
**研究背景与问题**
细胞外囊泡（extracellular vesicles，EVs）是直径通常为30–200 nm的脂质双层纳米颗粒，能够选择性地将蛋白质、脂质和核酸等分子货物从供体细胞转运至受体细胞，从而介导细胞间通讯并重编程远端微环境。由于EVs具有弱免疫原性且保留组织特异性归巢的表面配体，它们被视为再生医学和药物递送领域有前景的载体。然而，EVs的临床转化受到三个内在瓶颈的制约。其一，EVs产量低；例如，人间充质基质细胞在标准二维培养条件下每10^6个细胞24小时内仅分泌约1–4 μg的EV相关蛋白，对应每细胞约100–400个EV，而临床前小鼠研究通常每剂需要10–30 μg，早期临床试验则需要数百微克，导致制造成本极高。其二，分离流程繁琐耗时，密度梯度离心或超速离心方案需数小时、多步骤操作，且回收率不足25%。其三，天然EVs存在高度异质性，不同生物发生途径产生的囊泡在货物和功能上存在差异，供体间变异进一步扩大批次差异。这些问题共同阻碍了EVs的可扩展性和标准化。
为克服上述限制，细胞源性纳米囊泡（cell-derived nanovesicles，CDNs）应运而生。CDNs通过机械破碎培养细胞，使质膜自组装成囊泡而制得。系统比较显示，CDNs的产量通常比匹配的EVs制剂高10–100倍，显著缩短生产时间并降低成本。当前CDNs的制备方法包括氮气空化、探头超声、高压匀浆和微流控剪切处理等，其中通过聚碳酸酯膜连续挤压特别受青睐，因其可实现粒径均一化和规模化放大。CDNs保留了亲本细胞的天然膜结构和胞质成分，因此预期具备类似EVs的递送能力和归巢行为。然而，制造过程对囊泡-细胞相互作用的分子机制的影响仍知之甚少。尽管EVs和CDNs常具有相似的宏观理化性质（如直径和zeta电位），但制备过程中的机械输入可能改变膜蛋白的组成、丰度和取向，从而可能改变网格蛋白介导、非网格蛋白依赖、黏附驱动及巨胞饮等摄取途径之间的平衡。传统荧光成像和抑制剂筛选仅能提供定性快照，且受到通路串扰和脱靶效应的干扰。因此，亟需蛋白质组水平的图谱来关联人工囊泡组成与候选摄取相关特征。
**研究内容与结论**
本研究建立了一种双侧面蛋白质组学框架，将囊泡侧蛋白质组学与受体细胞TurboID邻近标记相结合，系统比较了尺寸相近的CDNs和sEVs在蛋白质组成及受体细胞分子界面上的差异。研究人员构建了MFGE8(D49E)–mCherry–TurboID嵌合体，其中MFGE8 C1C2结构域靶向磷脂酰丝氨酸富集膜，D49E突变减少吞噬细胞的非预期整合素结合。通过瞬时转染HEK293T细胞，机械破碎并经序列挤压制备TurboID-CDNs，同时通过差速超速离心制备TurboID-sEVs。研究表明，TurboID-CDNs与野生型CDNs在粒径和表面电荷上无显著差异，且具有完整的脂质双层结构和酶活性。全局蛋白质组分析显示，CDNs鉴定的蛋白质数量远多于sEVs（2733对935），且CDNs富集线粒体、核质和胞质组分，而sEVs富集EV和膜相关类别。基于囊泡侧蛋白质组的摄取途径倾向评分（route-propensity scores，RPS）预测，CDNs在巨胞饮、整合素辅助黏附、CLIC/GEEC、小窝蛋白介导、清道夫受体样及吞噬样等途径上展现出更广泛且更高的倾向性，而sEVs则主要与网格蛋白介导和HSPG辅助途径相关。受体细胞侧的SILAC标记邻近蛋白质组学进一步解析出不同的分子群组：CDN相关群组包含受体来源的CALR和NCL，分别与LRP1/CD91相关的胞葬识别和NCL相关的巨胞饮过程对应；sEV相关群组则包含与HSPG辅助锚定及网格蛋白或CLIC/GEEC相关摄取一致的签名。两类囊泡共享一个包含膜联蛋白和ERM家族连接蛋白的黏附-褶皱模块。药理学抑制实验显示，巨胞饮抑制剂EIPA对CDN内化无明显影响，提示CDNs可能通过多条部分补偿的途径进入细胞。综上，该研究揭示了机械挤压产生的CDNs与天然分泌sEVs在受体细胞分子界面上存在显著差异，并确定了可用于功能验证的特异性受体和通路候选靶点。
**主要技术方法**
本研究采用的关键技术方法包括：①基于TurboID的邻近标记技术，利用工程化大肠杆菌生物素连接酶TurboID在囊泡-细胞界面附近催化生物素化，从而标记受体细胞中与囊泡 transient association 的蛋白质；②稳定同位素标记氨基酸培养（SILAC）技术，受体细胞以重同位素标记（Arg10/Lys8），供体细胞为轻标（Arg0/Lys0），以区分蛋白质来源；③液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）进行蛋白质组鉴定和定量；④荧光激活细胞分选（FACS）富集mCherry阳性受体细胞；⑤纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）、成像流式细胞术等用于囊泡表征；⑥基于基因本体（GO）和定制通路特征签名的计算分析。样本来源为HEK293T细胞（购自日本RIKEN BRC），SILAC培养基使用无精氨酸/赖氨酸DMEM并补充去sEV胎牛血清。
**结果要点**
2.1 TurboID-CDNs的制备与理化表征：通过MFGE8(D49E)–mCherry–TurboID嵌合体表达和序列挤压成功制备具有酶活性的TurboID-CDNs；NTA和TEM确认均一球形囊泡；平均粒径156.3±3.8 nm，zeta电位?32.0±0.4 mV，与野生型CDNs及sEVs相似；Triton X-100处理降低荧光事件数，证实脂质双层完整性。
2.2 全局蛋白质组比较：LC-MS/MS鉴定出细胞3674个蛋白，TurboID-CDNs 2733个，TurboID-sEVs 935个；Spearman相关显示组内重复性好且三组间分离明确；CDNs富集EV相关类别，而sEVs额外富集膜和囊泡类别；CDNs特有蛋白涉及线粒体、核质和胞质组分。
2.3 基于囊泡蛋白组成的摄取途径预测：利用八种内吞模块的路线特征计算RPS；CDNs在MACRO、INTE、CLIC等途径上倾向性更高，而CAV、SCAV、PHAGO仅在CDNs中可检测；sEVs在HSPG和CME相关信号较弱；权重扰动分析显示结论稳健。
2.4 TurboID-CDNs的功能活性及受体细胞关联：体外ATP补充条件下检测到TurboID依赖性生物素化；荧光成像显示mCherry斑点信号与受体细胞相关；CCK-8实验证实4小时暴露浓度下细胞活力良好。
2.5 受体侧TurboID邻近标记鉴定候选摄取相关互作组：SILAC编码结合FACS分选，CDN暴露后获得mCherry阳性富集蛋白432个（膜相关183个），sEV暴露后获得700个（膜相关289个）；CDN特异候选包括CALR和NCL，sEV特异候选涉及HSPG相关锚定蛋白（如ANXA2）；共享子集包含膜联蛋白和ERM家族蛋白；EIPA处理未显著抑制CDN内化，支持多途径并存。
**总结与结论**
本研究建立的双侧面蛋白质组学框架将囊泡组成与受体细胞形成的分子界面联系起来。尽管挤压产生的CDNs与sEVs具有相似的宏观理化性质，但两者在蛋白质组结构和受体细胞邻近景观上差异显著。CDNs表现出更广泛的预测摄取相关特征，其受体细胞相关群组包含CALR和NCL，提示LRP1/CD91相关胞葬识别和NCL相关巨胞饮过程；sEV相关群组则与HSPG辅助锚定及网格蛋白或CLIC/GEEC相关摄取一致。这些互补数据表明，机械产生的CDNs通过不同于天然分泌sEVs的分子景观与受体细胞相互作用，并确定了用于功能验证的特异性受体和通路候选。虽然当前设计未直接建立受体依赖性，也未区分表面结合与内化，但研究解析了囊泡类型相关的分子差异，将后续实验聚焦于明确机制。该策略为解析囊泡-细胞通讯和合理设计具有更可预测细胞相互作用谱的细胞来源纳米载体提供了有力框架。论文发表在《Small Methods》。
