表面工程化多孔硅纳米粒子增强[Ru(bpy)?]2?电化学发光用于超灵敏免疫检测

《Talanta》：Surface-engineered porous silicon nanoparticles amplifying [Ru(bpy) 3]2+ electrochemiluminescence for ultrasensitive immunoassay

　　

摘要：

高灵敏度电化学发光（ECL）体系对于准确检测疾病相关细胞因子至关重要。本文首次采用轻度氧化多孔硅（MO-PSi）纳米颗粒作为多功能修饰材料，以增强三(2,2′-联吡啶)钌(II) [Ru(bpy)₃]²⁺/三丙胺（TPrA）体系的ECL信号，用于细胞因子免疫分析。将新鲜刻蚀的多孔硅（PSi）进行一步温和氧化处理，生成轻度氧化多孔硅（MO-PSi），在此过程中，表面Si-H基团转化为富含Si-OH基团的SiO_x层，同时保持多孔硅框架结构。值得注意的是，MO-PSi修饰的氧化铟锡（ITO）电极表现出比PSi或介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）修饰的ITO电极更高的ECL响应。性能提升主要归因于MO-PSi的表面工程。具体而言，Si-OH端基封端的SiO_x层赋予MO-PSi表面强负电荷，从而在电极界面实现阳离子[Ru(bpy)₃]²⁺的有效静电富集以进行ECL反应。此外，温和氧化处理钝化了表面缺陷，提高了修饰层的电化学稳定性，并促进了界面电子转移，共同导致ECL发射增强。作为概念验证，构建了两类免疫传感器，通过共价固定抗体至MO-PSi的Si-OH基团，分别检测细胞因子白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）。该传感平台对两种细胞因子均展现出从1 fg/mL到1 ng/mL的宽浓度范围，检测限分别为IL-1β 0.9 fg/mL和IL-6 0.3 fg/mL。本研究展示了使用MO-PSi修饰电极制备高性能ECL生物传感器的可行性。

引言

细胞因子在免疫调节、炎症反应和疾病进展中发挥关键作用，其水平是免疫状态和疾病严重程度的重要指标 [1]、[2]、[3]、[4]。通常，病理性免疫反应涉及多种细胞因子的协同作用，而非单一因素 [5]。例如，促炎细胞因子白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）水平的升高与多种慢性疾病（包括心血管疾病和癌症）的进展密切相关 [6]、[7]、[8]、[9]。因此，同时检测多种细胞因子对于提高疾病诊断的准确性和可靠性至关重要。目前用于细胞因子检测的免疫分析方法，包括酶联免疫吸附测定（ELISA）[10]、荧光光谱 [11]、化学发光 [12]和表面增强拉曼散射（SERS）[13]，虽然可靠，但仍面临操作复杂、耗时和成本高昂等挑战。开发高效的多种细胞因子免疫分析方法对于准确疾病诊断至关重要。

电化学发光（ECL）是一种结合了电化学和化学发光的高灵敏度分析技术 [14]、[15]、[16]。由于其背景信号低、可控性和快速响应特性，ECL已被广泛应用于各种生物标志物的临床免疫分析中 [17]、[18]、[19]。三(2,2′-联吡啶)钌(II)（[Ru(bpy)₃]²⁺）是一种常用的ECL发光团，具有优异的水溶性、高电化学稳定性以及与共反应物三丙胺（TPrA）进行ECL反应时的可再生性 [20]、[21]、[22]、[23]。为提升ECL性能，介孔二氧化硅纳米颗粒（MSN）或介孔二氧化硅薄膜等多孔纳米材料被广泛用于负载[Ru(bpy)₃]²⁺，从而减少试剂消耗并增加电极表面发光团的局部浓度 [24]、[25]、[26]、[27]。同时，二氧化硅表面丰富的Si-OH基团可用于构建免疫识别位点 [28]、[29]、[30]。然而，二氧化硅固有的绝缘性严重限制了电极界面的电子转移，从而限制了信号进一步放大的潜力。因此，开发一种具有高[Ru(bpy)₃]²⁺负载能力、优异表面功能化能力和良好导电性的替代硅基材料至关重要。

轻度氧化多孔硅（MO-PSi）是一种通过电化学刻蚀PSi工程化衍生的材料，是构建[Ru(bpy)₃]²⁺基ECL传感界面的优选替代方案。MO-PSi保留了原始PSi的优异结构特征，包括可调的介孔孔径和高比表面积，有利于反应物的快速扩散 [24]、[31]、[32]。此外，温和氧化过程可将PSi表面的Si-H键转化为Si-OH基团。这些Si-OH基团（pK_a 2.0～3.0）在生理条件下（pH = 7.4）可解离，产生带负电荷的表面，从而实现对带正电荷探针分子的静电富集 [33]。MO-PSi表面还表现出良好的可修饰性，可通过与氨基或环氧基团共价键合构建生物识别界面 [34]、[35]。MO-PSi与绝缘的MSN不同，其多孔硅框架仅经历表层氧化，形成一层薄的二氧化硅（SiO_x）层，同时保持底部的多孔硅框架 [36]、[37]。SiO_x层预计可在阳极扫描过程中防止电化学腐蚀，并通过表面缺陷钝化促进界面电子转移。然而，MO-PSi作为促进经典ECL体系发光的功能材料的潜力尚未被探索。

本文首次构建了一种基于轻度氧化多孔硅（MO-PSi）纳米颗粒的新型修饰电极，以增强[Ru(bpy)₃]²⁺/TPrA体系的ECL响应，用于细胞因子免疫分析（图1）。得益于MO-PSi独特的表面性质，MO-PSi修饰的氧化铟锡（ITO）电极的ECL强度远高于PSi或MSN修饰的ITO电极。SiO_x层上丰富的Si-OH基团赋予MO-PSi强负电荷，促进阳离子[Ru(bpy)₃]²⁺的静电富集，增加电极界面ECL反应中发光团的局部浓度。此外，MO-PSi表面形成的薄SiO_x层不仅钝化了PSi的表面缺陷，还确保了阳极ECL过程中界面的稳定性，从而促进电极界面高效电荷转移，改善ECL响应。接下来，利用MO-PSi上的Si-OH基团共价固定抗体，分别建立用于检测IL-1β和IL-6的独立功能界面。当抗体特异性捕获IL-1β或IL-6时，形成的免疫复合物可阻碍界面扩散并增加界面阻抗，导致ECL强度降低。基于这一免疫传感策略，成功实现了IL-1β和IL-6的超灵敏检测，检测限分别为0.9 fg/mL和0.3 fg/mL。MO-PSi作为ECL免疫传感器的界面修饰材料展现出卓越的潜力。

章节摘要

MO-PSi/ITO的制备

多孔硅（PSi）膜通过电化学刻蚀方法获得 [38]。具体而言，将硅片浸入氢氟酸（HF）和乙醇（体积比4:1）组成的电解液中，在恒定电流密度（77 mA/cm²）下进行600秒的电化学刻蚀。随后，将PSi膜从硅基体上剥离，在3.3% HF-乙醇溶液中以恒定电流密度22 mA/cm²进行180秒的电化学刻蚀。接下来，将剥离的PSi膜

MO-PSi的合成与表征

多孔硅（PSi）膜由[100]晶向硼掺杂p型硅片（电阻率：0.0005-0.0012 Ω·cm）通过典型的电化学刻蚀工艺制备，随后通过超声碎裂获得新鲜刻蚀的PSi纳米颗粒。将所得PSi浸入PBS溶液（0.1 M，pH = 7.4）中6小时，离心获得MO-PSi（图1A）。如图1B和图1C所示，MO-PSi的多孔结构和分散性与原始PSi相似。

结论

在本工作中，我们证明了使用MO-PSi作为界面修饰材料来放大[Ru(bpy)₃]²⁺ECL响应的可行性。MO-PSi富含Si-OH的表面表现出比Si-H端基封端的PSi表面更强的负电荷，有利于[Ru(bpy)₃]²⁺在电极表面的静电富集。此外，薄SiO_x层钝化了PSi的表面缺陷，提高了MO-PSi界面的电化学稳定性，从而优化了其电荷

CRediT作者贡献声明

吴建敏：写作 – 审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。席凤娜：写作 – 审阅与编辑、监督、资金获取、概念化。杨海：形式分析、数据整理。倪顺乐：写作 – 初稿、调查研究、形式分析。赵景文：写作 – 初稿、方法论、调查研究、资金获取、数据整理、概念化

利益冲突声明

作者声明，不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告工作的情况。

数据可用性

数据将应要求提供。

利益冲突声明

? 作者声明，不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告工作的情况

致谢

作者感谢国家自然科学基金（编号 22374130、22274138）和浙江省自然科学基金（编号 LQN26B050004）的资助。感谢浙江大学化学系分析测试平台提供的支持。

赵景文|倪顺乐|杨海|席凤娜|吴建敏

浙江理工大学化学与化工学院，浙江杭州 310018，中华人民共和国