3D 打印螺旋与收缩 - 扩张阵列级联微流控芯片结合 ICP-MS 用于循环肿瘤细胞的高效分选与在线检测

《Talanta》：3D-printed Spiral and Contraction-Expansion Array Cascaded Microfluidic Chip Combined with ICP-MS for Efficient Sorting and Online Detection of Circulating Tumor Cells

　　

摘要

癌症转移仍然是导致癌症相关死亡的主要原因，且与循环肿瘤细胞（CTCs）密切相关，后者作为液体活检的关键生物标志物具有重要意义。然而，CTCs在血液中的含量极低，需要高效且精准的分离与检测策略。本文报道了一种3D打印级联惯性微流控平台，该平台集成了螺旋模块和收缩-膨胀（CEA）模块，用于从全血中直接分离并单细胞定量分析CTCs。得益于高度可编程的3D打印技术，该器件能够实现多级微通道的精确调谐与集成，这是传统软光刻技术难以实现的。该系统无需外加场或血液预处理，仅依靠尺寸依赖的惯性聚焦即可实现高通量分离（110 μL min^-1）。结合单细胞电感耦合等离子体质谱（SC-ICP-MS），铕标记的CTCs在芯片富集后可通过特征信号脉冲进行直接定量。该平台实现了98.90%的CTCs回收率、99.37%的白细胞（WBC）去除效率和99.70%的红细胞（RBC）去除效率，分选后细胞存活率高（99.33%），纯度达72.34-99.07%。利用癌症患者和健康供体血液样本进行的临床验证表明，患者样本中CTCs计数范围为34至164 cells mL^-1，而对照组未检出CTCs。本工作提供了一种简便、标签增强且完全集成的微流控芯片-ICP-MS策略，用于高通量CTCs分析，并突显了3D打印高度可调微流控技术在临床液体活检应用中的优势。

引言

癌症仍然是全球主要的致死原因之一，转移性疾病占癌症相关死亡的大部分。在转移过程中，循环肿瘤细胞（CTCs）从原发肿瘤或转移灶脱落并进入血液，在肿瘤向远处器官扩散中发挥关键作用[1]。因此，从外周血中分离和检测CTCs已成为癌症早期诊断、疗效实时监测、预后评估及转移风险评价的有前景的方法。然而，CTCs检测的临床应用仍面临诸多重大挑战，包括其在血液中的含量极低（外周血中通常为0-10 cells mL^-1）以及显著的生物学异质性[2]。因此，开发高灵敏度和高可靠性的CTCs分离与检测策略仍然是癌症诊断和液体活检领域的主要目标。目前的CTCs检测方法包括免疫荧光染色[3]、RT-PCR[4]、表面增强拉曼光谱（SERS）[5]、电化学方法[6]和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）[7]、[8]。在这些技术中，ICP-MS因其超低的检测限、高灵敏度、宽广的线性动态范围、元素特异性检测和出色的多重分析能力而成为一种强大的分析平台。这些独特的分析优势使ICP-MS成为CTCs计数和表面蛋白表征的强大检测技术[9]。

微流控技术因其高通量、低试剂消耗和操作简便而成为CTCs分离与富集的有吸引力平台[2]。现有的微流控分离策略通常可分为主动和被动方法。主动技术如介电电泳（DEP）[10]、磁泳[11]、声操控[12]和光操控[13]，虽然选择性高，但通常受限于较低通量、复杂仪器和对细胞活力的潜在影响。相比之下，被动方法包括微滤[14]、[15]、确定性横向位移（DLD）[16]、[17]、黏弹性分选[18]、挤压流分选（PFF）[19]和惯性微流控分选[20]、[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]、[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]，可利用简单通道几何结构实现连续、无标记、高通量的细胞分离。其中，惯性微流控技术因其利用内在水动力学力实现无需外加场或标记的连续尺寸依赖细胞迁移而备受瞩目。

人们已开发了多种惯性微流控通道几何结构，包括直通道[20]、[21]、蛇形通道[22]、[23]、[24]、螺旋通道[25]、[26]、[27]、[28]、[29]、[30]、[31]、[32]和收缩-膨胀（CEA）通道[33]、[34]、[35]、[36]、[37]、[38]、[39]。直通道通常会在通道截面上产生多个平衡聚焦位置。蛇形通道具有较高的通量，但呈现复杂的聚焦模式。螺旋通道具有高通量，其分离性能可通过引入鞘流[30]、双螺旋构型[25]、[27]、梯形通道截面[36]和周期性膨胀结构[31]得到改善。CEA通道利用重复的收缩-膨胀结构诱导惯性迁移，在中等流速下实现稳定的尺寸依赖聚焦[35]、[36]、[37]、[38]。

尽管惯性微流控技术已取得长足进展，但单级器件仍无法同时实现高效的红细胞（RBC）去除、深层白细胞（WBC）消除和高CTCs回收率[40]、[41]、[42]、[43]、[44]、[45]。在复杂的全血样本中，RBCs和WBCs的巨大数量严重削弱了CTCs的富集和下游分析[2]。由于RBCs、WBCs和CTCs在尺寸、机械特性和水动力学迁移行为上存在差异，单一分离模块通常无法同时满足所有这些需求[43]、[45]。因此，集成多种互补功能分离模块的级联惯性微流控系统已成为背景细胞逐步消除和目标细胞富集的有效策略。例如，Shirai等[25]开发了一种混合双螺旋微流控系统，通过串联组合半迪恩流和全迪恩流分馏模式，实现从全血中连续消除血细胞并高效富集CTCs。最近，惯性微流控平台已与ICP-MS耦合，以实现CTCs的在线分析。Fu等[40]开发了一种基于非对称收缩-膨胀阵列（ACEA）的级联惯性微流控芯片，与ICP-MS集成，通过基于惯性升力和迪恩力的顺序WBCs消除，实现了对铕标记CTCs的直接在线检测，在300 μL min^-1的通量下，CTCs回收率为94.18%，WBCs去除效率为99.46%。然而，现有的级联惯性微流控系统主要设计用于去除特定背景细胞群体，从全血中同时高效多级去除RBCs和WBCs仍具有挑战性[40]、[42]。此外，使用传统软光刻技术将多个具有独立优化几何结构和水动力学条件的惯性分离模块集成为单一微流控器件仍然困难[41]。

三维（3D）打印作为一种有前景的制造策略，已用于级联惯性微流控系统的构建，可制造复杂的三维微流控结构。其独立调节通道高度的能力为将多种具有不同水动力学需求的功能模块集成到单一微流控平台提供了独特的设计灵活性。例如，Zhang等[41]开发了一种具有凹形截面几何结构的3D打印螺旋惯性微流控器件，实现了从全血中高效分离A549癌细胞，具有高的回收率和血细胞消除效率，凸显了3D打印在构建先进CTCs分离平台方面的潜力。

为应对这些挑战，本研究旨在开发一种3D打印级联惯性微流控芯片，耦合SC-ICP-MS，用于从全血中快速分离和在线定量分析CTCs。两种具有不同水动力学功能和通道参数的惯性分离模块——螺旋模块和CEA模块——通过3D打印进行集成。螺旋模块设计用于高通量消除大量RBCs和部分WBCs，而下游CEA模块则进一步消除残留WBCs，同时保持高效的CTCs聚焦。这种多级分离策略实现了高纯度CTCs富集和通过单细胞ICP-MS的在线CTCs检测。如图1所示，在样品引入前，CTCs首先通过抗EpCAM-Eu探针进行选择性标记。在螺旋模块中，大部分RBCs和部分WBCs被去除，而CTCs与剩余WBCs一起从内侧目标出口连续引入下游微混合器。在微混合器中引入的补偿流促进了细胞的快速重新分布和均质化，同时调节流条件以匹配后续CEA模块的最佳水动力学需求。在CEA通道中，剩余WBCs被进一步推向侧出口，而CTCs聚焦于通道中心，并直接送入ICP-MS进行在线单细胞检测。

各节摘要

仪器、试剂与标准溶液

采用安捷伦8900 ICP-MS（Agilent，日本）通过监测铕标记CTCs产生的瞬态¹⁵³Eu信号进行单细胞CTCs检测。主要运行参数见表S1。

单克隆抗体抗EpCAM（Sigma Aldrich，德国）用于特异性识别表达EpCAM的CTCs，并与铕螯合物偶联作为元素标记，用于单细胞ICP-MS分析。DOTA-NHS酯（1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸

芯片设计原理

本器件基于级联惯性微流控策略设计，集成了螺旋模块和CEA模块，以实现顺序血细胞消除和高纯度CTCs富集。如图2所示，一级螺旋通道采用双入口双出口构型（图2A）。双入口设计分别引入样品流和鞘流，使样品流被水动力约束在通道外壁附近，

结论

本工作开发了一种3D打印级联惯性微流控平台，集成在线单细胞ICP-MS检测，用于高通量CTCs分离和灵敏定量。通过利用3D打印的几何可编程性，该系统克服了传统软光刻技术的局限性，实现了具有可调通道高度的螺旋模块和CEA模块的无缝集成，同时消除了对外加力场和血液预处理步骤的需求。

CRediT作者贡献声明

Rui You：撰写初稿、研究方法、调查研究、形式化分析。Man He：审阅与编辑。Beibei Chen：审阅与编辑、验证、研究方法、概念化。Bin Hu：审阅与编辑、监督、研究方法、资金获取。

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

数据可用性

数据可根据要求提供。

竞争利益声明

? 作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系，这些利益或关系可能会影响本文所述工作的客观性。

致谢

本工作得到国家自然科学基金（编号：22374111、21974100、21775113）和中国教育部的资助。

Rui You|Beibei Chen|Man He|Bin Hu

武汉大学化学系，武汉，430072，中国