《Theriogenology》：Sequential refinement of ovum pick-up technical parameters improves oocyte recovery and developmental competence in Holstein cows
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摘要卵母细胞取卵（OPU）技术变异限制了牛体外胚胎生产（IVP）的效率与一致性。本研究通过对荷斯坦牛进行的七项累积实验中系统评估关键技术参数，建立了OPU的顺序优化框架。18 G吸引针的冠状卵母细胞复合体（COCs）回收率显著高于20 G和22 G针（53.05% vs. 4
摘要
卵母细胞取卵（OPU）技术变异限制了牛体外胚胎生产（IVP）的效率与一致性。本研究通过对荷斯坦牛进行的七项累积实验中系统评估关键技术参数，建立了OPU的顺序优化框架。18 G吸引针的冠状卵母细胞复合体（COCs）回收率显著高于20 G和22 G针（53.05% vs. 40.03–45.79%；p < 0.05）。90°插入相比非垂直插入改善了回收率（55.64% vs. 48.86%），而插入至卵泡深度的三分之一到二分之一以及斜面朝下方向进一步提高了回收效率（分别为56.52%和57.97%；p < 0.05）。聚氯乙烯（PVC）管道提供了更优的COCs回收率（63.29%）和形态质量，管道长度为1.2–1.5 m。50 mmHg真空压力获得了更高的COCs回收率（70.27%）和囊胚率（40.65%），显著优于之前使用的70 mmHg设置。相比之下，过高的吸引压力（80 mmHg）与线粒体功能障碍、皮层颗粒分布紊乱和凋亡增加相关（p < 0.05），表明过大的机械应力下卵母细胞核质成熟受损。值得注意的是，在整个顺序优化过程中，回收效率从53.05%逐步提高至70.27%。总体而言，本研究提供了OPU程序的田间优化方法，并展示了在测试条件下吸引参数与牛卵母细胞发育能力之间的关联。
引言
卵母细胞取卵联合体外胚胎生产（OPU-IVP）已成为加速奶牛和肉牛遗传改良不可或缺的生殖生物技术[1,2]。通过使从遗传优等供体重复、非手术地采集卵母细胞成为可能，OPU-IVP大大缩短了世代间隔并加速了优良遗传性状的传播[3]。尽管其已被广泛商业应用，但操作者间和批次间的大差异仍然是影响牛IVP系统效率、可重复性和可扩展性的主要限制因素。尽管供体相关因素如体况评分、年龄、产次和泌乳状态已知会影响卵母细胞能力[4,5]，但OPU技术程序中的不一致性是另一个常被忽视的变异来源，直接限制了下游胚胎生产效率[6]。OPU的成功取决于多个相互关联的技术参数，包括吸引针规格、插入角度和深度、斜面方向、管道材料和长度以及真空压力。这些参数共同决定了卵泡抽取过程中的吸引流体力学、机械剪切应力和冠状卵母细胞复合体（COCs）转运稳定性，从而不仅影响回收的COCs数量，还影响其结构完整性和发育能力[7,8]。例如，针直径影响吸引流动力学，较大规格的针可能提高回收率同时减少剪切对COCs的损伤[9,10]。真空压力也必须仔细校准：压力不足可能导致卵泡抽取不完全，而压力过高可能剥离冠状细胞并引起亚细胞损伤[11]。同样，管道特征和针操作技术可能显著影响卵母细胞质量，然而，这些因素在田间条件下很少被系统地整合评估[2]。先前的研究主要孤立地调查单个OPU参数，经常使用屠宰场来源的卵巢而非活体供体动物，从而限制了其向商业OPU-IVP项目的转化相关性[10,12]。此外，大多数研究主要关注卵母细胞回收率和总体形态质量，对次优化的吸引条件下下游发育和亚细胞后果的关注有限。据我们所知，没有先前的研究在活体商业OPU条件下系统地整合顺序参数优化与发育和超微结构评估。因此，仍需一个全面的、基于田间的优化方案，以累积方式系统地优化多个OPU参数，同时在商业设置中保持操作可行性。
因此，本研究的目的是：(1) 通过顺序实验设计系统评估吸引针规格、插入角度、插入深度、斜面方向、管道材料和长度以及真空压力对荷斯坦牛COCs回收、形态质量和发育能力的影响；(2) 表征过高吸引压力引起的超微结构损伤；以及(3) 建立经过田间验证的OPU框架，以改善商业牛IVP系统的效率和可重复性。
章节摘要
材料与方法
所有实验程序均获西北农林科技大学动物护理和使用委员会批准，并按照国家动物福利法规进行。
吸引针规格与COCs回收（实验1）
为了优化OPU期间的吸引针配置，使用每组50头供体比较了六种单腔针（22 G、20 G和18 G的短型和长型变体）。结果显示COCs回收率随针直径增加而逐步提高。18 G-S和18 G-L针获得了最高的回收率（分别为53.05%和52.05%），显著高于20 G组（45.59–45.79%）和22 G组（40.03–40.16%）（p < 0.05；
讨论
本研究建立了全面的、经过田间验证的牛OPU顺序优化框架，系统地整合了调节荷斯坦牛卵母细胞回收效率和发育能力的吸引相关生物力学参数。通过跨实验累积优化单个技术变量，我们确定了优化后的参数组合，包括18 G吸引针、90°插入至卵泡三分之一到二分之一深度
结论
本研究通过顺序优化吸引相关技术参数（包括针配置、管道特征和真空压力），为牛OPU提供了基于田间的生物力学优化框架。优化后的参数组合——18 G吸引针、90°插入、卵泡三分之一到二分之一深度、斜面朝下方向、1.2–1.5 m PVC管道和50 mmHg真空压力（对应10–15 mL/min的流速）——获得了改善的
CRediT作者贡献声明
李合强：撰写—初稿，软件，方法论，概念化。赵保宝：撰写—初稿，软件，方法论，概念化。王京亚：撰写—初稿，软件，方法论，概念化。宋学晓：撰写—审阅与编辑，验证，数据管理。范德祥：撰写—审阅与编辑，验证，数据管理。王永：撰写—审阅与编辑，验证，数据管理。王捷宇：撰写—审阅与编辑，验证，
数据可用性声明
本研究涉及的数据将在向通讯作者提出合理请求后提供。
资助
本工作得到科技2030重大项目（编号：2023ZD04075）、宁夏回族自治区重点研发项目（编号：2024BBF01005）和陕西干旱区农业实验室（编号：2024ZY-JCYJ-02-19）的资助。
利益冲突声明
作者声明没有已知的可能影响本论文报告工作的竞争经济利益或个人关系。
李合强|赵保宝|王京亚|宋学晓|范德祥|王永|王捷宇|李洋|徐子涵|王政|王庄生|清苏竹|金亚萍|王永生
西北农林科技大学动物医学与生物技术学院，陕西杨陵，712100，中华人民共和国
