表达CD::UPRT和TRAIL的工程化间充质干细胞在胶质母细胞瘤患者来源类器官中表现出强效抗肿瘤效果

《Cells》：Engineered Mesenchymal Stem Cells Expressing CD::UPRT and TRAIL Exhibit Potent Anti-Tumor Effects in Glioblastoma Patient-Derived Organoids

　　

胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度侵袭性的脑肿瘤，由于其侵袭性、治疗耐药性以及药物穿越血脑屏障（BBB）的挑战，治疗选择十分有限。间充质干细胞（MSCs）凭借其肿瘤趋向性和穿越BBB的能力，为靶向抗癌递送提供了一个有前景的平台。研究人员先前工程化了表达CD::UPRT和TRAIL以及趋化因子受体以增强肿瘤归巢的MSCs（MSC-CD-TRAIL；BM03）。本研究使用GBM患者来源类器官（GBOs）（具有临床相关性的体外模型）评估了BM03的抗肿瘤疗效。通过GBO–MSC共培养体系，与对照组和MSC-WT组相比，BM03显著增加了来自四例GBM患者的GBO中的细胞死亡并降低了细胞活力。在3D侵袭实验中，BM03处理的GBO表现出显著减少的侵袭性向外生长，同时伴有上皮-间质转化（EMT）标志物（Zeb1和Snail）和干细胞样标志物（Olig2和Sox2）的下调，尤其是在侵袭区域。GFAP表达保持不变，表明对肿瘤干细胞样细胞具有选择性靶向作用。活细胞成像进一步证明BM03浸润到GBO中，这与凋亡增加相关，表现为cleaved caspase-3水平升高。这些发现提供了基于类器官的临床前证据，支持进一步评估BM03作为基于MSC的GBM治疗策略。

胶质母细胞瘤（GBM）是中枢神经系统最常见的原发恶性肿瘤，世界卫生组织（WHO）将其归类为4级肿瘤，中位生存期仅12至15个月。传统疗法包括手术切除、放疗和替莫唑胺（TMZ）化疗，但疗效有限，主要原因包括治疗耐药、肿瘤弥漫性浸润以及大多数化疗药物难以穿透血脑屏障（BBB）。因此，亟需开发更有效的靶向递送策略。间充质干细胞（MSCs）因其固有的肿瘤趋向性和在脑微环境中存活的能力，成为理想的抗癌药物递送载体。研究人员前期构建了多功能工程化MSC平台BM03，其共表达胞嘧啶脱氨酶：：尿嘧啶磷酸核糖转移酶（CD::UPRT）和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），并过表达趋化因子受体CCR2和CXCR4。CD::UPRT可将BBB渗透性前药5-氟胞嘧啶（5-FC）局部转化为细胞毒性5-氟尿嘧啶（5-FU），而TRAIL可直接诱导肿瘤细胞凋亡，趋化因子受体增强肿瘤归巢。既往研究已在GBM细胞系和原位异种移植小鼠模型中证实BM03的抗肿瘤活性，但传统二维细胞培养和异种移植模型无法完全还原人GBM的细胞异质性和微环境复杂性。患者来源脑肿瘤类器官可保留原发肿瘤的组织学结构和细胞多样性，是更具临床相关性的临床前评价平台。本研究旨在利用患者来源GBM类器官（GBOs）评估BM03的多方面抗肿瘤疗效。

研究人员从四例GBM患者手术标本中建立GBO模型（GBO21-07、GBO21-08、GBO22-16、GBO23-01），并采用GBO–MSC共培养体系。实验优化了MSC接种密度（1×10⁴、2×10⁴、5×10⁴细胞/GBO），选定1×10⁴用于后续实验。共培养6小时后加入5-FC（100 μg/mL），总时长为72小时。主要方法包括：WST-8（CCK-8）法测定细胞活力；Calcein-AM/PI活死细胞染色；基于I型胶原和Matrigel的三维（3D）侵袭实验；免疫荧光（IF）和Western blot检测蛋白表达；活细胞时间序列成像及全封固3D共聚焦显微镜评估MSC迁移和浸润；cleaved caspase-3染色评估凋亡。

结果显示：1. BM03在GBOs中诱导细胞毒性。与未处理对照组和MSC-WT组相比，BM03处理组PI阳性死细胞比例显著增加，四个GBO模型中的细胞活力均显著下降。加入5-FC后，BM03+5-FC组比BM03单独处理组活力降低更明显，而单独5-FC或MSC-WT+5-FC无明显细胞毒性，表明CD::UPRT/5-FC前药转化增强了BM03的杀伤效应。2. BM03减弱GBOs的侵袭行为和干性。3D侵袭实验中，未处理和MSC-WT组GBO在培养7天后侵袭面积显著增加，而BM03处理组几乎无侵袭或侵袭面积明显减少，Western blot显示EMT转录因子Zeb1和Snail表达下调。IF和Western blot进一步发现，BM03处理组中神经干细胞/胶质瘤干细胞样标志物Olig2和Sox2表达显著降低，尤其Olig2在GBO周边的侵袭富集区域减少更为明显，而星形胶质细胞标志物GFAP表达在各组间无显著变化，提示BM03选择性靶向肿瘤干细胞样细胞而非正常分化细胞。3. BM03表现出增强的肿瘤趋向性和凋亡诱导能力。时间序列成像显示，CMFDA标记的BM03比MSC-WT更快地向GBO迁移并深入GBO核心，而MSC-WT主要停留在外周。全封固3D成像定量分析证实，BM03在GBO内的CMFDA阳性面积显著高于MSC-WT，且与cleaved caspase-3阳性面积增加相一致。Western blot进一步确认BM03处理组cleaved caspase-3水平升高，表明BM03浸润与凋亡激活相关。

讨论部分总结：该研究将BM03的临床前验证扩展至更接近真实肿瘤异质性的患者来源类器官模型。BM03在GBOs中展现出多重抗肿瘤活性：诱导凋亡、抑制侵袭、削弱干性。其细胞毒性机制涉及CD::UPRT/5-FC介导的前药转化和TRAIL相关活性，以及增强的肿瘤归巢能力。但研究中5-FC独立效应相对有限，提示在现有条件下前药转化是主要杀伤机制之一。BM03增强的肿瘤趋向性可能归因于CCR2和CXCR4对GBM分泌的趋化因子（如SDF-1α和MCP-1）的响应，促进深部肿瘤浸润。该研究存在局限性：仅使用四例患者来源GBO，样本量小，难以涵盖GBM的全部分子亚型；GBO模型缺乏完整的免疫、血管和药代动力学微环境；未直接评估BM03对正常脑细胞的毒性。未来需在免疫功能健全的体内模型及更大规模分子多样性类器官队列中进一步验证。

研究结论翻译：本研究中，表达CD::UPRT和TRAIL的多功能工程化MSC平台BM03在GBOs中表现出显著的抗肿瘤活性。BM03降低了GBO活力，诱导凋亡，抑制侵袭行为，并下调EMT和干性相关标志物。此外，其增强的迁移和浸润能力支持其作为GBM靶向细胞递送平台的潜力。这些发现将BM03的临床前验证扩展至能更好保留肿瘤异质性的患者来源类器官模型。结合既往体内研究，本研究为BM03作为机制合理的MSC治疗策略提供了互补的临床前证据。其肿瘤归巢特性和多模式细胞毒性活性现已在患者来源类器官中得到进一步验证，为未来转化开发奠定了更坚实的临床前基础。