褐环乳牛肝菌碱提多糖的提取工艺优化、结构特征及肠道菌群代谢调节作用

《Foods》：Extraction Process Optimization, Structural Characteristics and Gut Microbiota Metabolism Regulatory Effect of Suillus luteus Alkali-Extracted Polysaccharide

　　

摘要翻译：食用菌多糖已被公认为通过调节肠道菌群和宿主代谢而用于肿瘤辅助治疗的低毒性天然候选物。本研究旨在通过优化提取制备褐环乳牛肝菌碱提（pH = 9）多糖（SLP9），并基于多糖结构、属水平肠道菌群和粪便代谢组学系统阐明其抗肿瘤作用。通过高效凝胶渗透色谱（HPGPC）、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）进行的结构表征证实，SLP9含有丰富的β-糖苷键，其木糖:甘露糖:葡萄糖:半乳糖摩尔比为0.52:1.00:0.81:0.57，平均分子量约为1.58 × 10⁷ Da。体内抗肿瘤实验表明，高剂量SLP9表现出明显的肿瘤抑制作用，抑瘤率为40.28%，其机制涉及恢复微生物多样性和选择性富集有益菌属乳杆菌属（Lactobacillus），这可能与激活三条最重要的KEGG通路相关，即托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成、精氨酸生物合成以及由鸟氨酸、赖氨酸和烟酸衍生的生物碱生物合成。总之，本研究系统揭示了SLP9提取工艺、结构特征、肠道微生物代谢靶向调节与抗肿瘤活性之间的内在关联。这些发现为将SLP9用作肿瘤辅助治疗的新型微生态调节剂提供了全面的理论支持。

论文解读

1. 研究背景与科学问题

恶性肿瘤是威胁人类生命健康的重大全球公共卫生问题。近年研究表明，肿瘤的发生发展与肠道微生物组失调密切相关。肠道菌群多样性下降和结构失衡可导致肠道屏障损伤、全身慢性炎症和免疫功能紊乱，从而为肿瘤生长和转移创造有利微环境。肿瘤负荷又会进一步破坏肠道菌群稳态，形成“肿瘤进展—菌群失调—免疫抑制”的恶性循环。肠道微生物产生的许多重要代谢产物作为调控宿主免疫反应的关键信号分子，对宿主健康具有显著影响。因此，以调节肠道菌群组成和微生物代谢为靶点已成为一种新颖且安全的肿瘤辅助治疗策略。

食用菌多糖已被公认为通过调节肠道菌群和宿主代谢而发挥肿瘤辅助治疗作用的低毒性天然候选物。真菌多糖的生物学功能完全由其结构特征决定，包括分子量、单糖组成、糖苷键连接方式和分支度等。高分子量、富含分支的杂多糖不能被人体上消化道消化酶降解，能够完整到达结肠，作为有益肠道菌的特异性益生元。多糖的结构特征直接决定其对肠道菌群的发酵效率和选择性调节能力。适宜的糖苷键可显著富集乳杆菌等益生菌，优化微生物代谢通路，促进短链脂肪酸合成，并进一步激活宿主抗肿瘤免疫反应。因此，多糖结构特征对于调节肠道菌群代谢活动和发挥生物学效应至关重要。

褐环乳牛肝菌（Suillus luteus）是广泛分布于温带森林地区的外生菌根真菌，常用于改善根际土壤养分和积累重金属，同时也是中国传统的野生食用和药用蘑菇。该菌富含多糖、蛋白质、膳食纤维、维生素及多种生物活性次生代谢物，其中多糖被认为是核心功能成分。提取工艺显著影响多糖的结构特征和生物活性。与常规水提相比，碱提通常可获得更高的多糖回收率，并可能产生更优的生物活性。然而，针对褐环乳牛肝菌碱提多糖的系统研究仍较缺乏，其结构特征、肠道菌群代谢调节作用及抗肿瘤活性之间的内在关联尚不明确。为此，研究人员开展了本研究，旨在优化碱提工艺，系统表征多糖结构，并基于S180肉瘤荷瘤小鼠模型阐明“多糖结构—肠道菌群代谢—抗肿瘤效应”的调控轴。

2. 主要技术方法

研究人员从黑龙江购买的褐环乳牛肝菌干燥子实体为原料，采用正交实验优化碱提工艺。通过高效凝胶渗透色谱（HPGPC）测定分子量；气相色谱-质谱联用（GC-MS）结合甲基化分析测定单糖组成和糖苷键连接方式；傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征官能团；扫描电子显微镜（SEM）观察微观形态。动物实验使用SPF级昆明小鼠，经适应性饲养后随机分为空白组、模型组、环磷酰胺（CTX）阳性对照组、低剂量SLP9组（SLP9-L，100 mg/kg）和高剂量SLP9组（SLP9-H，200 mg/kg），通过皮下接种S180肿瘤细胞建立荷瘤模型。采用16S rRNA基因扩增子测序分析肠道菌群组成，采用非靶向代谢组学分析粪便代谢物。所有动物实验方案经天津科技大学伦理委员会批准（批准号：2023029）。

3. 研究结果

3.1 最佳提取工艺参数分析

通过L9(3³)正交实验以多糖得率为评价指标，考察提取温度、pH值和料液比三个变量。极差分析显示，各因素对褐环乳牛肝菌多糖得率的影响顺序为提取温度（R = 1.52）> 料液比（R = 0.29）> pH值（R = 0.21）。从实验室最高得率角度，最优组合为提取温度70 °C、pH = 10、料液比1:25 g/mL，对应试验5号，最高多糖得率为6.46%。方差分析表明，提取温度对粗多糖得率影响显著（p < 0.05），而pH值和料液比影响不显著（p > 0.05）。考虑工业化生产的经济效率，对得率无显著影响的因素采用最具成本效益的水平，最终确定适合放大生产的经济提取参数为：提取温度70 °C、pH = 9、料液比1:15 g/mL。三次验证实验平均多糖得率为6.32 ± 0.29%。经透析纯化获得碱提多糖SLP9，其总糖含量为91.58 ± 2.73%，蛋白质含量为3.95 ± 0.18%。

3.2 SLP9分子量与单糖组成分析

HPGPC图谱显示SLP9主峰保留时间为6.134 min，峰形对称，无明显拖尾和杂峰，表明SLP9具有较集中的分子量分布和良好的均一性。结合标准曲线计算，SLP9平均分子量约为1.58 × 10⁷ Da。GC-MS总离子流图成功分离出5个色谱峰，对应D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、D-半乳糖和肌酐内标。结果表明SLP9是一种杂多糖，其单糖摩尔比为Xyl:Man:Glc:Gal = 0.52:1.00:0.81:0.57。

3.3 SLP9特征官能团与表观形态分析

FTIR光谱显示，3416.41 cm^?1处宽而强的吸收峰归因于羟基（-OH）伸缩振动，2922.57 cm^?1和2852.45 cm^?1处的峰对应烷基的C-H伸缩振动，1640.07 cm^?1处的吸收来自结合水的弯曲振动和弱C=O伸缩，1073.72 cm^?1处的峰反映吡喃环上C-O-C糖苷键的伸缩振动。重要的是，876.75 cm^?1处的特征吸收带表明存在β型糖苷键，证实SLP9属于吡喃型多糖。SEM观察显示，在×100放大倍数下SLP9呈不规则片状碎片，尺寸不均匀；在×500放大倍数下，薄片边缘呈皱缩卷曲状，部分堆叠，表面相对光滑，表明多糖分子在冻干后聚集形成层状结构。

3.4 SLP9糖苷键构型分析

甲基化结合GC-MS分析鉴定出十种具有不同糖苷键连接方式的部分甲基化糖醇乙酸酯（PMAAs）。其中，(1→4)-Xylp比例最高（23.22%），其次为末端(1→)-Glcp（13.61%）、分支(1→3,6)-Manp（12.53%）和(1→6)-Manp（11.11%）。检测到三种双取代分支残基，即(1→3,6)-Manp、(1→4,6)-Glcp和(1→2,6)-Manp，合计占22.93%，表明SLP9具有较高的分支度。甲基化检测到的残基类型与单糖组成结果一致。

3.5 SLP9的抗肿瘤效果

各组小鼠肿瘤重量测定结果显示，模型组平均肿瘤重量为2.03 g；CTX处理后显著降至1.01 g（p < 0.05）；SLP9-L组和SLP9-H组的平均肿瘤重量分别为1.52 g和1.21 g，表明SLP9以剂量依赖方式抑制S180实体瘤生长。抑瘤率方面，CTX组最高达49.97%，SLP9-L组为25.17%，SLP9-H组增至40.28%。这些数据证实SLP9在体内具有明显的抗肿瘤作用，且抑制作用随剂量增加而增强，但效果低于阳性药物CTX。

3.6 SLP9对肠道菌群组成的影响

Venn图显示各组共有502个共享OTUs，空白组、模型组、CTX组和SLP9-H组特有OTUs分别为99、117、88和111个，表明肿瘤接种和药物干预重塑了肠道微生物组成。Chao1指数反映微生物群落丰富度，模型组Chao1值高于空白组，CTX处理降低了微生物丰富度，而SLP9-H补充增加了Chao1指数，恢复了荷瘤小鼠肠道菌群物种丰富度。在科水平上，SLP9-H组富集的生物标志菌群包括Muribaculaceae和Lactobacillaceae；肿瘤建模降低了Muribaculaceae、Lachnospiraceae和Lactobacillaceae的丰度，而SLP9-H表现出优于模型组的恢复能力。在属水平上，乳杆菌属（Lactobacillus）是SLP9-H组最突出的生物标志物，其在模型组中急剧下降，经SLP9-H给药后大幅恢复。此外，大肠埃希氏菌（Escherichia）在SLP9-H组富集，拟杆菌属（Bacteroides）、另枝菌属（Alistipes）、罗斯氏菌属（Roseburia）在各组间也观察到明显变化。因此，S180肿瘤攻击破坏了肠道微生物稳态，SLP9-H重塑了肠道菌群，提高了群落丰富度并选择性富集以乳杆菌为代表的有益菌属。

3.7 SLP9对肠道微生物代谢物的影响

非靶向代谢组学分析筛选出SLP9-H组与模型组之间的差异代谢物，共鉴定出66种显著差异代谢物，其中28种显著上调，38种显著下调。下调的代谢物主要包括甘油磷脂类（磷脂酰胆碱PC、磷脂酰肌醇LPC、溶血磷脂酰乙醇胺LysoPE和鞘脂类物质）、肉碱衍生物（ACar 18:3和ACar 20:2）、炎症介质（13,14-二氢-15-酮前列腺素E2、皮质酮等）、毒素及有害次生代谢物（呕吐毒素、粪胆素、胡椒碱、爱康宁及其甲酯等）。上调的代谢物主要包括胆汁酸（脱氢胆酸和鹅去氧胆酸）、氨基酸和核苷酸（DL-精氨酸、L-精氨酸和腺嘌呤）、三萜类化合物（18-甘草次酸、羟基熊果酸、羟甲基甾酮、蛇床子素糖苷等）。结果表明，SLP9重塑了S180荷瘤小鼠的粪便代谢谱：抑制促炎脂质和有害毒性代谢物的积累，提高有益胆汁酸、免疫调节氨基酸和微生物芳香族产物的水平。结合16S rRNA基因测序结果，SLP9介导的肠道菌群和粪便代谢物协同改变可能是其体内肠道保护和抗肿瘤作用的潜在机制。

3.8 SLP9对代谢通路的影响

KEGG通路富集分析显示，显著性排名前三的通路依次为：托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成（由C465爱康宁、C466爱康宁甲酯和C903胡椒碱介导，p = 0.0090）；精氨酸生物合成（由C387瓜氨酸和C563 L-精氨酸介导，p = 0.0157）；由鸟氨酸、赖氨酸和烟酸衍生的生物碱生物合成（由C466爱康宁甲酯、C563 L-精氨酸和C903胡椒碱介导，p = 0.0331）。在所有注释到的KEGG通路中，托烷、哌啶和吡啶生物碱生物合成富集最为显著，对应差异代谢物为含氮杂环生物碱，具有抗炎、抗氧化和免疫调节作用。精氨酸生物合成通路的显著上调与SLP9-H组的体内抑瘤效果及有益肠道菌属的显著富集相关。因此，SLP9同时激活氨基酸代谢和多种生物碱合成通路，精氨酸为生物碱产生提供前体，丰富的菌源生物活性生物碱共同缓解肠道炎症并增强宿主免疫力。

4. 讨论部分总结与结论

讨论部分围绕三方面展开。第一，提取工艺与多糖结构及构效关系。已有研究证实提取工艺决定真菌多糖的分子量、单糖组成、糖苷键连接方式和分支度。本研究采用pH = 9的温和碱提制备SLP9，含有丰富的β-糖苷键，分子量约为1.58 × 10⁷ Da。与同菌株热水提取多糖（分子量约1.90 × 10⁶ Da，抑瘤率53.14%）和酸提多糖（分子量约1.76 × 10⁷ Da，抑瘤率61.14%）相比，碱提SLP9的抑瘤率（40.28%）较低，提示较高的木糖含量和过高分子量可能不利于生物学活性的发挥，碱提条件对该菌株真菌多糖的生物学活性产生不利影响。第二，结构依赖的菌群—代谢物调控轴。非淀粉真菌多糖可抵抗上消化道消化酶降解而到达结肠，介导肠道菌群代谢重塑。SLP9的糖苷键和侧链单糖赋予其对菌群的选择性，属水平分析鉴定出乳杆菌属为SLP9-H组的特征生物标志物，与模型组乳杆菌耗竭形成对比。第三，生物碱和精氨酸代谢与抗肿瘤活性的关联。生物碱作为重要次生代谢物参与细胞增殖调控和免疫应答，精氨酸是调控抗肿瘤免疫的关键功能氨基酸。SLP9触发的代谢重编程可优化精氨酸周转以促进免疫细胞分化功能，并与生物活性生物碱代谢物协同增强抗肿瘤免疫监视、抑制肿瘤增殖。

研究结论：本研究在pH = 9弱碱条件下获得褐环乳牛肝菌杂多糖SLP9，其含有丰富的β-糖苷键，单糖摩尔比为Xyl:Man:Glc:Gal = 0.52:1.00:0.81:0.57，平均分子量约为1.58 × 10⁷ Da。动物实验结果表明，SLP9表现出剂量依赖性抗肿瘤作用，高剂量抑瘤率达40.28%，可重塑S180荷瘤小鼠紊乱的肠道菌群并特异性富集乳杆菌属，同时介导精氨酸和生物碱生物合成等显著KEGG通路。该研究阐明了提取工艺、多糖结构、肠道菌群代谢与抗肿瘤能力之间的潜在联系，为开发食用菌多糖作为微生态靶向的辅助抗肿瘤候选物提供了多维理论支持。论文发表在《Foods》。