《International Journal of Molecular Sciences》：Sarcosine Remodels DNA Methylation-Linked Transcriptional Networks During Epileptogenesis in the Rat Rapid Hippocampal Kindling Model
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DNA甲基化被认为参与癫痫发生过程。肌氨酸（Sarcosine，一种甘氨酸转运体1（GlyT1）抑制剂及甲基供体）可减轻快速海马点燃过程中的行为学进展并改变海马DNA甲基化，但其位点特异性表观遗传效应仍知之甚少。本研究将简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）与靶
DNA甲基化被认为参与癫痫发生过程。肌氨酸（Sarcosine，一种甘氨酸转运体1（GlyT1）抑制剂及甲基供体）可减轻快速海马点燃过程中的行为学进展并改变海马DNA甲基化，但其位点特异性表观遗传效应仍知之甚少。本研究将简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS）与靶向基因表达分析相结合，分析肌氨酸处理的点燃大鼠海马组织。RRBS分别在vehicle点燃组vs假手术组（vKD vs. vSH）、肌氨酸点燃组vs假手术组（sKD vs. vSH）以及肌氨酸点燃组vs vehicle点燃组（sKD vs. vKD）的比较中鉴定出563、533和390个差异甲基化区域（DMRs），对应521、499和374个DMR关联基因。通路富集分析识别出217条显著受影响通路，包括谷氨酸能信号、细胞外基质（ECM）组织、染色质调控、轴突导向和凋亡过程。研究人员选取11个参与表观遗传调控、兴奋性神经传递和ECM重塑的候选基因进行转录验证。所有11个基因在点燃海马中均显著上调，而相对于vehicle点燃大鼠，肌氨酸与其中8个基因（Hdac9、Fos、Smad7、Unc5a、Grik2、Gpr37l1、Cacna2d2和Yy1）的表达降低相关。综上，这些发现表明肌氨酸在快速海马点燃过程中重塑DNA甲基化关联的转录网络，并支持GlyT1抑制作为实验性癫痫发生中一种潜在的疾病修饰策略。
《International Journal of Molecular Sciences》刊发的该研究围绕癫痫发生（epileptogenesis）缺乏疾病修饰疗法这一未满足需求展开。现有抗癫痫发作药物（ASMs）仅抑制急性与慢性惊厥，无法阻断或逆转癫痫发生；既往证据提示全基因组DNA甲基化改变伴随DNA甲基转移酶（DNMT）活性增高见于颞叶癫痫（TLE）及多种实验模型，但位点特异性甲基化如何与转录输出耦合、能否被干预逆转仍不清楚。研究人员此前发现肌氨酸（N-甲基甘氨酸，兼具GlyT1抑制与一碳代谢甲基供体作用）可减轻大鼠海马点燃行为进展，并改变5-甲基胞嘧啶（5mC）/5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）水平，遂设计本研究整合甲基化组与转录组，明确其是否关联重塑甲基化偶联的转录网络。
主要关键技术方法如下：研究人员采用雄性Sprague–Dawley大鼠（280–300 g，n=6/组，sKD组RRBS因质控剔除1例留5例）建立5天快速海马点燃模型，分vehicle假手术（vSH）、vehicle点燃（vKD）、肌氨酸点燃（sKD，3 g/kg iP每日刺激前30 min）三组；海马组织右半球行简化代表性亚硫酸氢盐测序（RRBS，MspI酶切、Bisulfite转换、Illumina NextSeq 500双端75 bp，≥10×覆盖CpG保留），左半球行定量PCR（qPCR）靶向验证11个候选基因；生信端以Limma定差异甲基化胞嘧啶（DMC）、Comb-p定DMR（相邻≤300 bp、FDR<0.05、|Δβ|≥10%），按最近转录起始位点（TSS）映射基因，并行epiPathway、Gene Ontology（GO）及Metascape通路富集。
研究结果各节结论浓缩如下。
2.1节肌氨酸衰减快速海马点燃行为进展：vKD组第5天Racine评分4.6±0.3，sKD组2.5±0.8（p<0.05），证实肌氨酸关联行为惊厥减轻。
2.2节全基因组DNA甲基化改变：vKD vs vSH获264高/299低甲基化DMR；sKD vs vSH获387高/146低甲基化DMR；sKD vs vKD获304高/86低甲基化DMR，肌氨酸组高甲基化DMR在TSS上游1–3 kb比例更高；映射得521/499/374个DMR关联基因，无三向共有基因，25基因为sKD双向共有集。
2.3节比较通路富集：vKD与sKD低甲基化DMR基因共富髓系白细胞迁移、谷氨酸受体信号、Notch、胶质发生；高甲基化富激酶活性正向调控、化学突触传递调制、突触后组装；sKD vs vKD高甲基化富发育生长、髓鞘形成、TGF-β应答，低甲基化富ECM组织、内质膜系统、O-糖链生物合成。
2.4节点燃关联甲基化通路（vKD vs vSH）：高甲基化集（251基因）富谷氨酸能突触（ko04724）、神经元系统、血浆膜包被细胞突起组织调控、HDAC Class I；低甲基化集（284基因）富IL-6、趋化因子、白细胞分化、胶质发生正向调控、板状伪足组织。
2.5节肌氨酸关联甲基化通路（sKD vs vKD）：高甲基化集（295基因）富发育生长（GO:0048589）、脑发育（GO:0007420）、氯离子跨膜转运、TGF-β应答（GO:0071559）、突触组装正向调控；低甲基化集（85基因）富ECM组织（R-HSA-1474244）、钠离子转运、小GTP酶信号调控。
2.6节候选基因转录验证：11基因（Hdac9、Fos、Smad7、Unc5a、Dzip1、Yy1、Grik2、Gpr37l1、Cacna2d2、Antxr2、Spock2）在vKD均显著高于vSH；sKD相对vKD下调Hdac9、Fos、Smad7、Unc5a、Grik2、Gpr37l1、Cacna2d2、Yy1至近vSH水平；Dzip1、Antxr2、Spock2在sKD仍高于vSH且不低于vKD，未被肌氨酸显著衰减。
讨论部分总结：研究人员指出点燃关联DMR富集于兴奋性突触、染色质调控、神经炎症及结构重塑，与已知癫痫发生分子架构一致；肌氨酸关联DMR并非简单回向假手术态，而呈独特高甲基化偏倚（发育/突触/TGF-β）与低甲基化偏倚（ECM/离子转运），且8个候选mRNA下调伴行为减轻，但因DMR-基因仅按最近TSS映射、bulk海马未分细胞类型、肌氨酸兼具GlyT1抑制与一碳代谢作用，不能断言甲基化介导其行为效应或GlyT1单一机制。局限包括单剂量单性别快速点燃、无放电阈值/后放电时长量化、RRBS覆盖CpG密集区有限。
结论部分译文：利用快速海马点燃，RRBS鉴定出vehicle点燃、肌氨酸点燃及假手术大鼠海马的组间DMR模式；DMR关联基因富集于转录调控、突触信号及ECM重塑注释。靶向qPCR显示vehicle点燃海马11个候选基因mRNA上调；肌氨酸处理关联8个候选基因表达降低及测试方案下行为惊厥进展衰减。这些发现识别出伴随快速海马点燃与肌氨酸处理的甲基化关联分子网络，但未证明单个DMR调控基因表达或甲基化改变介导肌氨酸关联惊厥衰减；因肌氨酸具多重生物作用且GlyT1依赖性未直接检验，需进一步细胞类型分辨与机制研究以确定所识别通路是否参与癫痫发生或可作为疾病修饰靶点。
