《International Journal of Molecular Sciences》：A Conserved Macrophage-to-Hepatic Stellate Cell PDGF Axis in Human MASH Identified by Multi-Cohort sc/snRNA-Seq Re-Analysis
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代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(MASH)通过巨噬细胞活化和肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)驱动的纤维化发生而进展。由于细胞水平的单细胞发现常受伪重复(pseudoreplication)影响且难以在队列间重复，本研究采用严格的逐
代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(MASH)通过巨噬细胞活化和肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)驱动的纤维化发生而进展。由于细胞水平的单细胞发现常受伪重复(pseudoreplication)影响且难以在队列间重复，本研究采用严格的逐供体(per-donor)统计框架对人类肝脏单核RNA测序数据进行了批判性再评估，以区分不变的生物学信号与技术伪影。研究人员对数据集GSE202379中的巨噬细胞和HSC区室在临床分期(健康、代谢功能障碍相关脂肪性肝病、MASH)中进行了分析。细胞水平统计量被聚合为逐供体指标，并采用Jonckheere–Terpstra(JT)趋势检验评估连续表型变化。关键发现在两个独立队列(GSE136103和GSE244832)中进行了跨队列重复性检验。一个249基因的瘢痕相关巨噬细胞(scar-associated macrophage, SAMac)程序在发现队列中表现出可重复的、分期依赖性扩增(疾病-only谱系，即MASLD至晚期MASH的逐供体Jonckheere–Terpstra趋势，z = 2.23, p = 0.026[主要分析]；包含健康基线的全四期分析z = 2.74, p = 0.006)，并在外部数据中获得方向性重复。细胞间通讯分析在两个外部队列中均重复了保守的巨噬细胞-至-HSC PDGF轴的受体侧拓扑结构，并在外部snRNA-seq队列(GSE244832)中重复了配体驱动的PDGFC→PDGFRB边，PDGFRB是HSC纤维化相互作用网络中的高度连通性枢纽。重要的是，一个先前发表的全局HSC活化模块未能验证成功(JT p = 0.77)；然而，其核心细胞外基质和RUNX1/2亚轴保持稳健，而广泛声称的AP-1/JUNB调控驱动因子在单核RNA-seq队列数据的转录水平上未获得支持。这些发现与酶解离scRNA-seq数据中分离相关的即早基因(immediate-early gene)反应一致，因为在冻存组织队列中观察到转录水平平坦至下降的趋势；然而，转录水平数据不能排除蛋白或磷酸化水平的AP-1活性。已验证核心架构中可靶向的下游组分已被注释。通过实施逐供体验证，研究人员成功地将MASH的稳健病理特征与平台依赖性伪影分离开来。经验证的SAMac程序和巨噬细胞-HSC PDGF轴，连同相关的RUNX亚程序，代表了高置信度、经重复性筛选的候选治疗节点，仍需功能验证。这些发现为单细胞转化研究建立了重复性优先(reproducibility-first)标准，且经验证的程序与MASH中器官间炎症回路的新兴模型相一致。
**研究背景与科学问题**
代谢功能障碍相关脂肪性肝炎(MASH)是全球重大健康挑战，是肝硬化、肝衰竭和肝细胞癌的重要驱动因素。肝纤维化程度与患者长期死亡率密切相关，是MASH的关键预后决定因素。慢性损伤的肝脏微环境触发复杂细胞级联反应，其中持续固有免疫(巨噬细胞)活化刺激肝星状细胞(hepatic stellate cell, HSC)转分化为分泌细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的肌成纤维细胞。单细胞/单核RNA测序(single-cell/single-nucleus RNA sequencing, sc/snRNA-seq)技术虽已促进对肝内细胞异质性的理解，并鉴定了瘢痕相关巨噬细胞(scar-associated macrophage, SAMac)等特化亚群，但存在两个关键瓶颈：一是细胞水平分析常将同一供体的细胞视为独立样本，导致伪重复(pseudoreplication)偏倚，膨胀I型错误和假阳性发现；二是传统酶解离流程可扭曲天然转录状态，诱导即早基因应激反应。因此，未经严格跨队列验证的单细胞来源靶点易受队列特异性或平台依赖性结论影响。为此，研究人员开展了本研究，旨在通过逐供体统计框架和多队列外部验证，分离MASH中稳健的病理特征与技术伪影。
**研究设计与关键方法**
研究人员从基因表达综合数据库(Gene Expression Omnibus, GEO)获取发现队列GSE202379(snRNA-seq，覆盖健康、MASLD、早期MASH和晚期MASH连续临床谱系)及两个独立外部验证队列：GSE136103(酶解离CD45?/CD45?非实质细胞scRNA-seq)和GSE244832(多区域snRNA-seq)。采用Harmony整合与Leiden聚类进行细胞分群；实施逐供体伪bulk聚合(每供体区室≥20个核)，以edgeR进行差异表达分析，以Jonckheere–Terpstra(JT)检验评估有序分期单调趋势；使用LIANA框架进行配体-受体通讯推断，STRING构建蛋白-蛋白相互作用网络，并利用独立MASLD Visium空间转录组图谱(35张切片，48,196个质控后斑点)验证细胞空间共定位。
**研究结果**
**2.1 逐供体、外部验证的MASH巨噬细胞-HSC生物学再分析**
研究人员对GSE202379中5442个巨噬细胞和HSC核进行再分析，以经典标志物定义巨噬细胞区室(2390个核，含1567个Kupffer/单核样、823个SAMac样)和HSC区室(3052个核，含2015个静息、1037个活化)。所有分期趋势均在供体水平检验，外部比较采用不依赖特征基因的指标。三个核心发现(SAMac分期扩增、巨噬细胞→HSC PDGF轴、全局HSC活化模块)在两个独立队列中接受验证。
**2.2 SAMac表达连贯的内在程序并随疾病分期扩增**
249基因SAMac内在特征(edgeR, FDR<0.05)以GPNMB(log2FC +7.05)、FABP5(+6.35)、CD9(+5.05)和HS3ST2(+4.07)为最强改变基因。在预设的疾病-only谱系(MASLD→MASH→晚期MASH)中，逐供体SAMac比例单调增加(JT z=2.23, p=0.026；中位数22.7%升至40.3%)，巨噬细胞活化评分同步上升(JT z=2.10, p=0.036)；含健康基线的四期敏感性分析方向不变(JT z=2.74, p=0.006)。亚聚类解析出三个可重复的SAMac亚状态(Kupffer样、脂质相关、NF-κB/TLR活化)，其中NF-κB/TLR活化亚状态随临床分期扩增(JT z=2.67, p=0.008)，且扩散伪时间排序呈Kupffer样→脂质相关→NF-κB/TLR活化轴。TREM2、SPP1和OLR1未达内在显著性，提示SAMac程序由更广泛的脂质处理和ECM相互作用模块定义。
**2.3 巨噬细胞至HSC PDGF串扰轴及RUNX亚程序汇聚于PDGFRB网络枢纽**
LIANA框架建模恢复供体普遍的巨噬细胞-HSC双向回路：主要巨噬细胞→HSC边为PDGFC→PDGFRA和PDGFC→PDGFRB(CellPhoneDB置换p<0.001)，活化HSC经胶原感知(COL1A1→CD44/CD36)向巨噬细胞反向信号。PDGFRB是HSC活化蛋白相互作用网络中的高连通度枢纽(degree 20)，嵌入COL1A1、TAGLN、THBS1、ACTA2、CCN2/CTGF等核心纤维化节点之间。逐供体分析(n=30)显示PDGFC?SAMac丰度与HSC PDGFRB下游转录反应正相关(Spearman ρ=0.54, p=0.002；校正分期后偏ρ=0.49, p=0.006)，且分解后仅PDGFRB受体枢纽亚轴在校正后仍显著耦合(偏ρ=0.46, p=0.011)。独立Visium空间转录组在分层置换零模型下证实SAMac-high与PDGFRB?HSC-high斑点局灶共富集(中位数1.26倍，33张可评估切片中26张富集，p=1.7×10
?4)，且该空间亲和性不随分期变化(JT z=?0.10, p=0.92)。
**2.4 外部验证I：SAMac分期扩增跨队列重复**
在GSE136103中，以不依赖特征基因的TREM2/CD9/GPNMB锚定分析，SAMac比例从健康肝的3.5%升至肝硬化肝的18.0%(逐供体Mann-Whitney p=0.008, n=5 vs 5)；249基因SAMac特征的逐供体伪bulk log2 fold-change在发现与验证队列间方向一致(Spearman rho=0.29；上调占比69.5%；符号检验p=6.4×10
?9)。三个SAMac亚状态亦被恢复，肝硬化组NF-κB/TLR活化亚群呈非显著升高(66%至76%, p=0.42)。
**2.5 外部验证II：HSC活化模块不可移植；ECM/RUNX亚轴重复而AP-1驱动因子在转录水平不受支持**
与此相对，全局HSC活化特征在GSE244832中未能泛化：HSC活化评分在NORMAL、MASL、MASH三组间无升高(JT p=0.77；Kruskal-Wallis p=0.69)，基因组范围方向一致性缺失(Spearman rho=0.02)。但聚焦的ECM/RUNX亚轴重复成功，EFEMP1(log2FC +2.1)、LTBP2(+1.9)、RUNX2(+1.4)和RUNX1(+0.9)在MASH中显著或接近显著上调(EFEMP1和RUNX2 FDR=0.019)。相反，AP-1家族(JUN、JUNB、FOS、FOSB、JUND、ATF3、FOSL2)转录水平平坦至下降，均未达显著性(所有p≥0.18)，与酶解离scRNA-seq中分离相关即早基因反应的假说一致；但snRNA-seq对胞质即早转录本代表性不足，不能排除蛋白或磷酸化水平AP-1活性。
**2.6 外部验证III：巨噬细胞至HSC PDGF拓扑保守且LIANA边在snRNA-seq中重复**
两个外部队列中PDGFRB均在HSC富集(GSE244832：35.2% HSC vs 0.8%巨噬细胞；GSE136103：61.5% vs 0.4%)，snRNA-seq队列中配体PDGFC在巨噬细胞富集(39.5% vs 7.7%)。LIANA建模在GSE244832中恢复巨噬细胞→HSC PDGFC→PDGFRB边为显著且高度细胞类型特异(CellPhoneDB p<0.001；特异性秩聚合=0.003)，但相互作用强度仅中等(幅度秩聚合=0.40，748条测试边中排名第175)。GSE136103因PDGFC低于10%表达比例检测阈值而无法评估配体驱动边(归类为"不可评估"而非"未重复")，但该队列中PDGFRB由HSC自分泌配体(MFGE8、PDGFA)接合，受体臂仍活跃。
**讨论与结论**
讨论部分指出，249基因SAMac程序的高重复性支持其作为患者分层和伴随诊断的稳健基线；SAMac表型包含TREM2和MS4A7等功能组分而非被动标志物。PDGFRB作为高连通度枢纽，PDGFC→PDGFRB界面代表经技术变异仍存续的稳健信号通路，支持评估PDGFRB靶向药物(如尼达尼布、伊马替尼的再利用)，但该轴目前仅为经重复性筛选的候选节点，其因果作用和治疗价值仍需功能验证。全局HSC活化模块的验证失败提示将HSC活化视为均一全局表型会过度简化MASH发病机制，抗纤维化策略应聚焦保守的RUNX相关核心结构程序；RUNX1/2无已批准的直接靶向药物，近期治疗开发更可能经PDGFRB信号等上游输入或下游ECM效应子间接实现。AP-1/JUNB的转录水平阴性结果与酶解离诱导即早基因反应的证据一致，但不能排除蛋白或磷酸化水平活性，直接蛋白和磷酸化水平验证是必要的。从系统角度看，验证的肝内程序与脾-肝轴新兴模型一致，SAMac特征可能代表系统性募集的髓系细胞在纤维化肝脏微环境中的定型极化状态。研究局限性包括：发现队列健康基线仅2个可用供体(疾病-only谱系为预设主要分析)；计算相互作用组依赖转录丰度，PDGFC在CD45分选scRNA-seq中低于检测阈值；数据均为横断面快照；snRNA-seq对胞质即早转录本代表性不足；缺乏匹配脾脏样本；需体内功能拯救实验和高分辨率空间多组学进一步验证。
结论：本研究强调在单细胞转化基因组学中采用"重复性优先"(reproducibility-first)标准，通过逐供体验证框架降低了平台和解离依赖性技术变异，构建了经重复性筛选的MASH纤维化候选通路图谱，该图谱在两个独立队列中部分验证。这些经重复性筛选的通路为假说驱动、功能验证的治疗设计提供了更可靠的起点(而非已验证的药物靶点本身)，同时该框架为未来单细胞转化研究中的数据稳健性评估提供了建设性工作流程。
