肺泡上皮细胞硫过硫化蛋白质组揭示钙卫蛋白硫过硫化对其抗真菌活性的维持至关重要

《iScience》：The persulfidome of alveolar epithelial cells reveals persulfidation of calprotectin as critical to preserve its antifungal activity

　　

硫过硫化是一种翻译后修饰，涉及靶蛋白半胱氨酸残基上硫醇基团（-SH）向过硫化基团（-SSH）的特异性转化。该修饰在众多生理与细胞过程中发挥关键作用。研究人员此前已证明宿主细胞硫过硫化水平影响针对真菌病原体烟曲霉（Aspergillus fumigatus）的抗真菌免疫效能。本研究进一步阐明硫过硫化与免疫应答的关系。为此，研究人员界定了受烟曲霉攻击和/或暴露于提升细胞硫过硫化水平的硫化物供体下肺泡上皮细胞的硫过硫化蛋白（persulfidome）。研究结果表明，硫过硫化通过RNA代谢与翻译的改变间接调控免疫。此外，钙卫蛋白在烟曲霉暴露时发生硫过硫化，该修饰对于氧化应激下维持其免疫相关功能不可或缺。结果提示硫过硫化对广义与特异性免疫应答均具正向影响。

研究背景与立项依据

烟曲霉（Aspergillus fumigatus）是一种全球分布的丝状腐生真菌，其产生的空气传播分生孢子（conidia，2–3 μm）易被人体吸入。在免疫失衡宿主中可引发侵袭性曲霉病（IA），死亡率极高，且唑类耐药率上升进一步加剧威胁。固有免疫与呼吸上皮的协同清除是防御核心，而翻译后修饰调控免疫日益受到关注。内源性硫化氢（H₂S）由胱硫醚-β-合成酶（CBS）、胱硫醚-γ-裂解酶（CTH）及3-巯基丙酮酸硫转移酶（MST）生成，其主要机制之一即通过硫过硫化（persulfidation，半胱氨酸-SH→-SSH）调节蛋白功能。研究人员前期发现，造血干细胞移植患者中CTH基因功能缺失变异导致肺部硫过硫化活性下降，IA风险升高，且CTH^?/?肺泡上皮细胞呈现吞噬异常、杀孢子缺陷与细胞因子失调。基于此，本研究在《iScience》发表，旨在绘制肺泡上皮细胞persulfidome，解析硫过硫化在抗烟曲霉免疫中的直接与间接作用，并锁定钙卫蛋白（calprotectin，S100A8/S100A9异二聚体）为关键效应分子。

主要技术方法概览

研究人员以人肺泡腺癌来源A549细胞及其CRISPR编辑衍生物A549^CTH?/?、A549^S100A9?/?（CalP^?）为模型，烟曲霉ATCC46645及GFP标记株为感染源；采用硫化物供体GYY4137提升硫过硫化。蛋白级鉴定依托dimedone-switch法富集硫过硫化蛋白，液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量，结合标记无参标准化；下游网络分析采用带符号加权基因共表达网络分析（WGCNA）与DEqMS差异丰度模型；功能验证包括分生孢子杀伤实验、IL-8 ELISA、MitoSOX线粒体ROS检测、体外钙卫蛋白过硫化/高氧化重构、Zn²⁺螯合（DNAzyme 17E荧光法）及胰蛋白酶保护实验；Western blot以MAC387确认内源钙卫蛋白硫过硫化比值。

研究结果（按原文小标题浓缩）

硫化物供体增强肺泡上皮细胞抗真菌作用：GYY4137在A549中模拟烟曲霉诱导的硫过硫化水平上升；于CTH^?/?细胞中恢复分生孢子杀伤力，但在A549亲本中不再叠加杀伤增益，却特异性提升A549的IL-8分泌，CTH^?/?无此响应，提示硫化物供体效应依赖CTH基线状态且表型多元。

不同感染与供体条件下差异硫过硫化蛋白揭示硫过硫化调控RNA代谢与感染应答：跨四条件（±GYY4137，±A. fumigatus）persulfidome显示KEGG富集于内吞、剪接体、感染通路，GO富集于RNA代谢/加工/翻译；WGCNA分模块显示A549富集模块（MEgrey60、MEturquoise）指向RNA剪接与翻译，CTH^?/?富集模块补偿性关联Rac/Ras信号与核转运；烟曲霉特异模块（MEblack、MEpurple）关联RNA剪接与线粒体自噬/染色质重塑，硫化物供体模块（MEsalmon、MEbrown、MEgrey）关联微管/蛋白酶体/tRNA处理。MEgrey60（16蛋白）为细胞类型与真菌共有的核心模块，含RTCB、DDX5、SRSF7、MYO1E、RAB14、SIRT6等潜在免疫直接靶点。

挑战下硫过硫化水平改变蛋白的筛查将钙卫蛋白列为免疫应答候选连接者：DEqMS宽松阈值筛得84个差异蛋白，KEGG富集坏死性凋亡、氨基酸代谢、中性粒细胞应答；STAT6双刺激下去硫化，NCCRP1真菌单/双刺激均升硫化；S100A9在双刺激（+G+A）特异性升硫化。研究人员假设钙卫蛋白硫过硫化可拮抗氧化应激降解。

钙卫蛋白硫过硫化在氧化应激下维持其功能：CalP^?细胞杀伤与IL-8双缺陷；补回重组钙卫蛋白恢复杀伤但不恢复IL-8；高氧化（HOCl）钙卫蛋白丧失救援能力；体外预硫过硫化后再高氧化，恢复野生型水平杀伤且显著提升IL-8（未达野生型）。机制上，高氧化钙卫蛋白Zn²⁺螯合（DNAzyme 17E荧光回升）受损，预硫过硫化保护螯合；胰蛋白酶消化实验显示高氧化加速降解，预硫过硫化抵抗蛋白酶解。

硫过硫化参与线粒体ROS生成，但非CTH缺失杀伤缺陷主因：烟曲霉轻微升mitoROS，CTH^?/?静息与感染mitoROS均显著高；mitoTEMPO清除mitoROS不能挽回CTH^?/?杀伤，排除mitoROS为驱动主因。

钙卫蛋白硫过硫化部分解释CTH^?/?细胞缺陷应答：A549 vs CTH^?/?跨条件比较中，无刺激时基础硫过硫化改变，加GYY4137抹平差异，真菌单刺扩大差异；GO富集“响应真菌”（GO:0009620）获LTF、DCD、BCL-10、S100A8——后者Western证实CTH^?/?钙卫蛋白硫过硫化比值下降。补回体外硫过硫化钙卫蛋白部分恢复CTH^?/?杀伤（不恢复IL-8），证明钙卫蛋白硫过硫化是CTH缺陷抗真菌表型的直接贡献分支之一。

讨论与结论翻译

研究人员指出，硫过硫化对细胞抗真菌应答的影响主要是间接的，可能通过其作用于细胞骨架动力学、细胞能量学、RNA代谢与蛋白翻译而实现；硫过硫化在编排有效免疫应答中的作用大于直接杀灭烟曲霉。然而，重要抗菌肽钙卫蛋白的硫过硫化可在通常导致其周转的氧化条件下保全其功能；感染期中性粒细胞等吞噬细胞产生的高浓度氧化剂本可降解钙卫蛋白并削弱活性，硫过硫化对此具缓冲作用。因此钙卫蛋白硫过硫化构成与烟曲霉高效清除的直接链接。鉴于硫过硫化直接与间接靶点的复杂性，后续需体内整合免疫研究以全阐机制。研究局限为未将硫过硫化丰度归一化至总蛋白量，无法严格区分化学计量变化与表达量平行变化，但生物学结论仍成立。