荧光假单胞菌外膜蛋白中抗鱼类主要病原菌（荧光假单胞菌与嗜水气单胞菌）的候选疫苗

《Life》：The Vaccine Candidates Against Major Fish Pathogens (Pseudomonas fluorescens and Aeromonas hydrophila) from the Outer Membrane Proteins of P. fluorescens in Fish

　　

疫苗在提供针对细菌种类的免疫保护方面表现出更高效率，使其在 aquaculture（水产养殖）中具有潜在价值。本研究克隆并纯化了荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）的24种外膜蛋白（OMPs），制备了16种OMP小鼠抗血清，滴度均超过1:3200。随后，使用这16种抗血清被动免疫鲫鱼（Carassius auratus）并以病原菌攻毒。结果显示，五种OMP抗血清（PF0542、SurA、PF1798、PF2253和PF4616）以及全OMP血清对荧光假单胞菌和嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）感染提供的免疫保护率超过60%（p < 0.05）。此外，这五种OMP抗血清降低了炎症细胞因子和抗氧化因子的mRNA表达（p < 0.05），并对肾、脾和肠组织的结构完整性具有保护作用。另外，使用这五种鉴定出的OMP对鲫鱼进行主动免疫后攻毒表明，这些蛋白能激活鱼类非特异性免疫反应，赋予针对荧光假单胞菌和嗜水气单胞菌感染的免疫保护，降低炎症细胞因子和抗氧化因子的mRNA表达（p < 0.05），并保护肾、脾和肠的组织结构。综上，这五种OMP（PF0542、SurA、PF1798、PF2253和PF4616）可激活鲫鱼免疫反应，赋予抗细菌感染的保护力，并在细菌攻毒后表现出与保护相关的炎症/氧化应答减弱以及内脏结构维持效应。因此，这五种OMP有望作为针对鱼类被动和主动免疫中细菌感染（荧光假单胞菌和嗜水气单胞菌）的候选疫苗。

研究背景与立项依据

水产养殖为全球提供丰富蛋白质营养并产生显著经济效益，但病原菌感染每年造成巨大经济损失。荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens）为革兰氏阴性杆菌，可致鲫鱼、鲈鱼、鲤鱼等出现体表炎症、烂鳍、红皮病，且为人畜共患病原；嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）为淡水鱼类细菌性败血症主要病原，3至5天快速发病并引发群体死亡。当前防控主要依赖抗生素，但滥用致耐药菌涌现、吞噬细胞功能受抑、药物残留与环境污染；中草药起效慢，疫苗研究尚处起步。重组蛋白亚单位疫苗尤以多价蛋白疫苗兼具安全与高效，而革兰氏阴性菌外膜蛋白（OMPs）占外膜面积约半，直接参与宿主互作并具强免疫活性，已有OmpF、TdrA、Tdr1-3及OmpA/OmpC/OmpK等报道，但针对荧光假单胞菌OMP的系统筛选及跨种交叉保护仍不足。该研究由研究人员发表于《Life》，旨在从荧光假单胞菌ATCC 13525的24个已知OMP中筛选具免疫原性且能交叉抗嗜水气单胞菌的候选抗原，为淡水养殖多价疫苗奠基。

主要关键技术方法

研究人员以荧光假单胞菌ATCC 13525与嗜水气单胞菌ATCC 35654为靶菌，鲫鱼（Carassius auratus，15±1.5 g）购自安徽阜阳绿养水产，昆明小鼠（20±1.5 g）购自安徽医科大学，蛋鸡为辅助模型；从NCBI获取24个OMP基因（GenBank: LT907842.1），经PCR克隆入pET-32a、转化E. coli BL21诱导表达并Ni-NTA纯化，内毒素去除后以小鼠制多克隆抗血清并用Western blotting定特异性与滴度；以鲫鱼为模型，先用全OMP血清及16种单一OMP血清做被动免疫（腹腔转输抗血清2 h后LD₅₀攻毒，荧光假单胞菌3.0×10⁹ CFU、嗜水气单胞菌4.0×10⁹ CFU），计算相对存活率（RPS）；继而对筛选出的5种OMP做主动免疫（2 μg/g，弗氏不完全佐剂，三次间隔14天）后攻毒；检测血清溶菌酶（LZM）、免疫球蛋白M（IgM）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）及抗氧化指标丙二醛（MDA）、过氧化氢酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）；取肾、脾、鳃做qRT-PCR测il-6、il-8、tnf-α、il-1β（以gapdh校正，2^?ΔΔCt法）；脏器石蜡切片HE染色并半定量评分；统计用SPSS 19.0单因素ANOVA-Tukey与Kaplan–Meier生存分析。

研究结果

3.1 全OMP小鼠血清对鲫鱼的被动免疫保护：全OMP血清被动免疫后攻毒，抗荧光假单胞菌RPS 61.5%（p < 0.01）、抗嗜水气单胞菌RPS 57.1%（p < 0.01）；血清MDA/CAT/GSH-Px/SOD下降（p < 0.05），肾肝脾鳃中il-6/il-8/tnf-α/il-1β mRNA下调（p < 0.05），证实全OMP抗血清具双菌保护并伴炎症/氧化减轻。

3.2 24个OMP克隆表达纯化：PCR、双酶切、测序、SDS-PAGE确认24个重组OMP分子量与理论一致，纯化后单带。

3.3 抗血清特异性与滴度：仅16/24 OMP诱出特异抗血清（Western blotting单带、滴度>1:3200），其余8个无天然表位识别力，进入后续筛选。

3.4 16种OMP血清被动保护初筛：抗荧光假单胞菌RPS最高五者为PF2253（78.6%）、PF4616（78.6%）、SurA（71.4%）、PF1798（71.4%）、PF0542（64.3%），p < 0.01。

3.5 五OMP血清抗荧光假单胞菌被动保护：五组存活率显著高于空白血清；血清抗氧化四项降低（p < 0.05），炎症四基因在肾脾鳃下调（p < 0.05）；病理显示对照组肾肾小球细胞凋亡、脾细胞间隙扩大、肠绒毛坏死脱落，五OMP组结构完整、病变评分显著低于对照（p < 0.05）。

3.6 五OMP血清抗嗜水气单胞菌被动交叉保护：RPS为PF0542 61.5%、SurA 69.2%、PF1798 53.8%、PF2253 53.8%、PF4616 53.8%（p < 0.05）；抗氧化指标降（p < 0.05），PF0542/SurA/PF1798炎症基因下调明显，PF4616不显著；病理评分同前趋势。

3.7 五OMP主动免疫非特异性应答：鲫鱼主动免疫后血清ACP、AKP、IgM、LZM显著升高（p < 0.05），证明激活非特异性免疫。

3.8 五OMP抗荧光假单胞菌主动保护：RPS为PF0542 66.7%、SurA 77.8%、PF1798 77.8%、PF2253 66.7%、PF4616 77.8%（p < 0.05）；抗氧化与炎症基因变化同被动；病理评分显著降低（p < 0.05）。

3.9 五OMP抗嗜水气单胞菌主动交叉保护：RPS为PF0542 81.8%、SurA 54.4%、PF1798 54.4%、PF2253 90.9%（p < 0.05），PF4616 45.5%（p > 0.05不显著）；抗氧化降、炎症基因下调、脏器病变轻于对照。即PF0542/SurA/PF1798/PF2253具主动交叉保护，PF4616仅被动有效。

讨论部分总结

研究人员指出，OMP为公认多价疫苗线索，既往对副溶血弧菌、嗜水气单胞菌OMP被动筛查已验证范式，本研究以小鼠快繁多克隆血清初筛、鲫鱼被动→主动两级评价，是最大规模荧光假单胞菌OMP筛选（24个中得5个跨双菌保护）。被动保护反映外源抗体急性相效力，不替代鱼体自身应答；主动免疫中Freund佐剂与腹腔注射仅为实验室策略，应换Montanide ISA 763A、浸浴或口服、纳米/孢子递送以适配产业。BLAST显示PF0542与嗜水气单胞菌YfiB/OmpA家族覆盖54%/43%，SurA与嗜水气单胞菌SurA/肽基脯氨酰异构酶覆盖74%/22%，PF2253与外排泵外膜亚基/OprM/TolC家族覆盖95%/79%/60%，提示序列同源可能引交叉反应抗体，但需表位映射确证。观测到的炎症/氧化指标下降更应解释为免疫控菌后负担减轻的间接效应，而非OMP直接抗炎；未来须做杀菌/巨噬细胞刺激、抗原特异性ELISA、长效保护及更多病原验证。

结论翻译

总之，研究人员克隆纯化荧光假单胞菌24种OMP并制备16种小鼠抗血清。被动与主动免疫表明，五种OMP（PF0542、SurA、PF1798、PF2253、PF4616）可激活先天免疫活性，具免疫保护率，在鲫鱼感染荧光假单胞菌或嗜水气单胞菌后下调抗氧化相关因子（MDA、SOD、CAT、GSH-Px）与炎症基因（il-6、il-8、il-1β、tnf-α）表达，并维护内脏器官保护力。其中PF0542、PF1798、PF2253、PF4616为鱼类新鉴定保护抗原，SurA首次报道为候选疫苗。本研究贡献在于鉴定出五种可作水产养殖被动与主动免疫候选疫苗的OMP。