长孢枝瑚菌(Ramaria longispora)线粒体基因组特征与系统发育分析

《Mitochondrial DNA Part B》：Mitochondrial genome characteristics and phylogenetic analysis of Ramaria longispora

　　

本研究首次利用高通量测序技术组装并注释了长孢枝瑚菌（R. longispora）的完整线粒体基因组。该基因组是一个环状分子，总长度为157,712 bp，GC含量为31.55%。它编码71个基因，包括15个核心蛋白编码基因（PCGs）、25个转移RNA（tRNA）基因、2个核糖体RNA（rRNA）基因、5个游离开放阅读框（ORFs）和24个内含子ORFs。其中，大多数游离ORF功能未知，但包含一个DNA聚合酶基因，而内含子ORF主要编码LAGLIDADG和GIY-YIG内切酶。线粒体基因组包含39个内含子。基于15个核心PCGs，使用贝叶斯推断（BI）和最大似然（ML）方法进行的系统发育分析显示，该长孢枝瑚菌与Ramaria flavescens和Ramaria ichnusensis亲缘关系最近。本研究为枝瑚菌属（Ramaria）线粒体基因组研究提供了基础数据，并为该属的分类学和进化研究提供了重要参考。

枝瑚菌属（Ramaria）隶属于担子菌门（Basidiomycota）、伞菌纲（Agaricomycetes）、钉菇目（Gomphales），是一类广泛分布的珊瑚状真菌，具有重要的生态功能和经济价值。该属大多数物种为外生菌根真菌，与松科（Pinaceae）和壳斗科（Fagaceae）等树木形成共生关系，在森林生态系统物质循环和群落构建中发挥关键作用。此外，部分枝瑚菌物种具有食用或药用价值，受到研究者关注。然而，枝瑚菌属形态特征复杂，种间界限模糊，给传统分类学研究带来局限，亟需分子系统发育数据加以补充。

线粒体基因组具有结构保守、进化速率适中、母性遗传等特点，已成为真菌系统发育学、群体遗传学和进化生物学研究的重要分子标记。近年来，高通量测序技术的发展推动了真菌线粒体基因组学研究的显著进展，为解决真菌类群间的系统发育关系提供了新视角。例如，Li等（2022）首次报道了两个枝瑚菌物种的线粒体基因组，揭示了该类群在基因排列和内含子动态方面的进化特征。然而，目前枝瑚菌属线粒体基因组数据仍相对有限，妨碍了对其基因组多样性和进化历史的全面理解。为此，研究人员首次对长孢枝瑚菌（Ramaria longispora Marr & D.E. Stuntz 1974）的线粒体基因组进行了测序、组装和注释，分析其结构特征、基因组成和内含子分布，旨在丰富枝瑚菌属的线粒体基因组数据，为该属的分类修订和进化生物学研究提供基础信息。该研究成果发表于《Mitochondrial DNA Part B》。

研究人员于2024年在中国云南省南华县（101.27°E, 25.24°N）的针阔混交林中采集了长孢枝瑚菌的子实体，通过形态学和分子鉴定确认物种归属（与R. longispora标本MHHNU9241 PP493503的ITS序列相似性为99.35%）。主要技术方法包括：使用真菌DNA提取试剂盒提取总DNA，构建NEBNext Ultra II DNA文库，并在Illumina HiSeq 2500平台进行双端测序；利用ngsShoRT和AdapterRemoval v2进行质量控制，使用NOVOPlasty v4.3.3进行从头组装；通过MFannot、MITOS和NCBI ORF Finder进行初步注释，结合BLASTP进行功能注释，tRNAscan-SE用于tRNA基因鉴定，PMGmap用于绘制环状基因组图谱；内含子类型通过与Rfam数据库比对及文献确定。系统发育分析选取15个保守线粒体核心蛋白编码基因，从NCBI GenBank下载其他10种担子菌的对应序列，以Tuber calosporum为外类群，经MAFFT比对和SequenceMatrix串联后，利用PartitionFinder确定最佳分区与取代模型，分别采用贝叶斯推断（BI）和最大似然（ML）方法构建系统发育树。

研究结果显示，长孢枝瑚菌线粒体基因组测序平均覆盖深度为577.59×，组装获得一个环状基因组，总长157,712 bp，GC含量为31.55%。碱基组成不对称，A（33.67%）和T（34.77%）比例较高，G（14.85%）和C（16.70%）比例较低。基因组注释共鉴定71个基因，包括15个核心蛋白编码基因（atp₆、atp₈、atp₉、cob、cox₁、cox₂、cox₃、nad₁、nad₂、nad₃、nad₄、nad₄L、nad₅、nad₆和rps₃）、2个rRNA基因（rnl和rns）、25个tRNA基因、5个游离ORF和24个内含子ORF。游离ORF中，除一个编码DNA聚合酶外，其余编码功能未知蛋白；内含子ORF主要编码LAGLIDADG和GIY-YIG家族内切酶。该线粒体基因组共含39个内含子，分布于多个蛋白编码基因中，依据结构和保守序列特征可分为17个Group IB、6个Group I（衍生）、4个Group IA、2个Group IC、2个Group ID、1个Group II以及7个未定型内含子。系统发育分析基于15个核心蛋白编码基因的串联数据集，BI和ML方法构建的系统发育树拓扑结构一致，且各节点具有高支持值。结果显示，本研究的长孢枝瑚菌与Ramaria flavescens和Ramaria ichnusensis聚为一支，表明它们之间亲缘关系最近，支持该物种属于枝瑚菌属，并与上述两个物种具有较近的共同祖先。

讨论部分指出，长孢枝瑚菌线粒体基因组显著大于大多数其他担子菌，这与其富含内含子的特征密切相关。该物种所含内含子数量远超先前报道的Ramaria rubella和Ramaria cf. rubripermanens，提示枝瑚菌属内可能存在显著的内含子动态变化。内含子作为“自私”遗传元件，其插入和丢失是真菌线粒体基因组大小和结构变异的重要驱动力。本研究鉴定的多种Group I内含子及一个Group II内含子，反映了长孢枝瑚菌线粒体基因组内含子组成的高度多样性。此外，研究人员在游离ORF中发现一个DNA聚合酶基因，可能参与线粒体DNA的复制与修复；此前此类基因在真菌线粒体基因组中并不常见，更多以核基因形式存在，其出现可能源于水平基因转移或基因迁移事件，其功能与进化意义有待深入研究。

研究结论可概括为：本研究首次报道了长孢枝瑚菌的完整线粒体基因组，揭示了其基因组结构、基因组成和内含子分布特征，并通过系统发育分析确认了其与Ramaria flavescens和Ramaria ichnusensis的亲缘关系。该研究为枝瑚菌属线粒体基因组研究提供了基础数据，也为该属的分类学与进化研究提供了重要参考。