《Fermentation》：Yeast-Mediated Pre-Fermentation Modulates the Fecal Microbiome In Vitro in a Genotype-Dependent Manner
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本研究探讨了酵母介导的预发酵对现代和古代小麦基因型组成及功能特性的影响，并进一步评估了其对肠道微生物发酵的后续影响。研究人员使用酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）（6%，w/w）在30 °C下对全麦粉进行预发酵6 h。将未发酵及预
本研究探讨了酵母介导的预发酵对现代和古代小麦基因型组成及功能特性的影响，并进一步评估了其对肠道微生物发酵的后续影响。研究人员使用酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*）（6%，w/w）在30 °C下对全麦粉进行预发酵6 h。将未发酵及预发酵的全麦样品依次进行体外上消化道消化，随后进行单糖组成分析、使用由三名健康供体制备的合并接种物进行体外粪便发酵、微生物谱分析以及短链脂肪酸（SCFA）定量。发酵提高了福林–乔卡勒特（Folin–Ciocalteu）反应值及抗氧化能力，同时降低了消化后残留淀粉和蛋白质的含量，表明消化衍生残渣的组成发生了改变。经*S. cerevisiae*发酵后，单糖分析显示葡萄糖相对富集，而阿拉伯糖和木糖比例下降。在体外粪便发酵后，基于Bray–Curtis相异度，预发酵小麦样品与其未发酵对应物相比，微生物群落结构存在显著差异（p < 0.001，AMOVA），而α多样性的差异相对有限。此外，与碳水化合物发酵及SCFA产生相关的分类群，包括*Parabacteroides distasonis*、*Butyrivibrio crossotus*和*Kineothrix*，表现出处理及基因型依赖性响应。所有小麦样品均能支持SCFA产生，尽管其SCFA积累较菊粉更为平缓。总体而言，酵母介导的预发酵与小麦组成的变化及随后粪便微生物群落结构和发酵动态的改变相关，且不同小麦基因型之间的响应存在差异。
全谷物因其富含膳食纤维、酚类化合物及其他生物活性成分而被视为重要的膳食组分，常规摄入与心血管疾病、2型糖尿病及结直肠癌等慢性病风险降低相关。这些健康效应主要归因于不可消化碳水化合物，尤其是阿拉伯木聚糖和β-葡聚糖，它们在调节肠道菌群组成和代谢活性方面发挥核心作用。然而，麦麸膳食纤维结构复杂且异质，大部分碳水化合物被包埋于植物细胞壁基质中或与蛋白质和淀粉结合，限制了其在结肠中的生物可及性和可发酵性。食品加工技术可显著改变膳食纤维的组织结构和理化性质，其中发酵作为增强谷物食品营养与功能品质的策略日益受到关注。发酵过程中的微生物和酶活性可导致细胞壁多糖部分解聚、释放结合态酚类化合物以及改变淀粉–蛋白质相互作用。然而，酵母介导的预发酵（特别是作为消化前预处理）对消化道消化衍生残渣的组成及其后续微生物利用的影响仍未得到充分研究。此外，古代与现代小麦基因型在纤维组成、细胞壁结构及加工耐受性方面的差异可能导致不同的发酵结局。本研究旨在探究酵母介导的预发酵对现代和古代小麦基因型消化衍生残渣组成的影响，并评估其与后续肠道微生物组成和代谢活性的关联。研究采用酿酒酵母（*Saccharomyces cerevisiae*，6%，w/w）在30 °C下对全麦粉进行预发酵6 h，随后进行模拟上消化道消化获得消化衍生残渣，并进行单糖组成分析、体外粪便发酵、微生物群落谱分析和SCFA定量。通过整合组成学、微生物学和代谢学分析，研究探索了消化衍生小麦残渣组成与肠道微生物响应及SCFA产生之间的潜在关联。
研究人员采用简化实验室预发酵模型，而非最终食品制作过程，以尽量减少面团形成、面筋网络生成、醒发和焙烤等技术因素的干扰，从而受控地评估预发酵过程相关的组成变化及其与后续可发酵性的关联。研究材料包括硬粒小麦（*Triticum durum* Desf. cv. K?z?ltan-91）、普通小麦（*Triticum aestivum* L. cv. Esperia）、密穗小麦（*Triticum compactum* Host cv. Karaduman）作为现代小麦，以及斯佩耳特小麦（*Triticum spelta* L.）、一粒小麦（*Triticum monococcum* L.）和二粒小麦（*Triticum dicoccum* Schrank ex Schübl.）作为古代小麦，所有样品均收获于2023年，产自土耳其不同地区。全麦粉经锤式粉碎机（<500 μm）制备。预发酵采用面粉与蒸馏水1:15（w/v）混合形成浆液系统，加入面包酵母（6%，w/w，约6 × 10
7 CFU/g面粉），在30 °C恒温振荡水浴中密闭发酵6 h，随后经对流干燥（50 °C）至水分约10%并重新粉碎（<500 μm）。未经处理的生小麦面粉作为对照。化学组成分析采用标准AACC方法测定水分、灰分、蛋白质和脂肪含量。总酚含量（TPC）使用福林–乔卡勒特（Folin–Ciocalteu）试剂法测定，以没食子酸当量（GAE）表示；抗氧化能力采用DPPH、FRAP和CUPRAC三种方法测定，结果以Trolox当量（TE）/g干物质表示。体外上消化道消化按照Tuncil等方法进行，包括淀粉糊化、胃蛋白酶胃消化和胰酶/淀粉葡萄糖苷酶肠消化，乙醇沉淀回收不可消化残渣。单糖组成经硫酸水解、衍生化为糖醇乙酸酯后采用GC/MS测定。体外粪便发酵在厌氧条件下进行，使用碳酸盐–磷酸盐缓冲液和半胱氨酸盐酸盐还原剂，以菊粉为阳性对照，无底物为阴性对照；粪便样品来自三名健康供体（一男两女，27–37岁），合并制备接种物；在0、6、12、24和48 h取样进行SCFA定量和DNA提取。SCFA采用GC-FID定量。16S rRNA基因V4–V5区扩增后经Illumina MiSeq平台测序，使用Mothur软件（v1.48.0）进行序列处理、OTU划分和分类学注释，β多样性基于Bray–Curtis距离并通过AMOVA检验显著性，α多样性指数包括observed species、Chao、inverse Simpson和Shannon。统计分析使用GraphPad Prism 10，以双因素方差分析评估基因型（六个水平）、预发酵状态（未处理vs.发酵）及其交互效应，事后比较采用Tukey检验。
预发酵显著影响所有小麦样品的化学组成。双因素方差分析显示，基因型和预发酵对所有近邻组成参数均有显著主效应，且水分、蛋白质和脂肪存在显著的基因型×预发酵交互作用，而灰分的交互作用不显著，表明预发酵对水分、蛋白质和脂肪的影响幅度因基因型而异。发酵样品的水分含量普遍低于未处理对照，而灰分、蛋白质和脂肪差异较小。古代小麦品种的灰分和蛋白质含量普遍高于现代小麦。预发酵显著提高了大多数样品的Folin–Ciocalteu反应值和抗氧化能力（DPPH、FRAP和CUPRAC），且古代小麦品种的抗氧化能力普遍较高。TPC、DPPH、FRAP和CUPRAC均观察到显著的基因型×预发酵交互作用，表明预发酵对抗氧化相关参数的影响依赖于小麦基因型。
上消化道消化后，所有样品的残渣中仍可检测到残留淀粉，表明存在未被水解的淀粉部分。预发酵样品消化后残渣中的残留淀粉和蛋白质含量均低于其未处理对应物，且所有小麦基因型均表现出一致趋势，但幅度随基因型而异。这些结果表明，预发酵与消化后回收残渣组成的基因型依赖性差异相关，可能反映了发酵引起的谷粒基质变化影响了消化期间淀粉和蛋白质的水解程度。
消化衍生残渣的单糖组成分析显示，所有样品中葡萄糖、阿拉伯糖和木糖是主要单糖。预发酵与相对单糖组成的一致变化相关，所有基因型的葡萄糖相对比例从31.4–51.3%升至55.6–63.0%，而阿拉伯糖从23.4–38.4%降至18.1–22.3%，木糖从18.6–24.6%降至11.4–13.9%；阿拉伯糖/木糖（Ara/Xyl）比值降低。该变化在现代化和古代小麦中均存在，但幅度因基因型而异。由于GC/MS分析完全酸水解后定量单糖，且未包含酵母单独对照，故无法区分小麦来源和酵母来源碳水化合物，也不能直接证明阿拉伯木聚糖的分子去支链化或结构重组；这些结果应解释为预发酵小麦样品的组成特征，而非小麦膳食纤维结构修饰的直接证据。
基于Bray–Curtis距离的主坐标分析显示，初始接种物、空白和菊粉组间的微生物群落结构无显著差异，而所有小麦处理（无论是否预发酵）均诱导了与初始接种物和空白显著不同的群落结构变化。更重要的是，未处理和预发酵小麦样品之间的群落结构亦存在显著差异（p < 0.001，AMOVA），表明预发酵改变了肠道微生物对小麦底物的群落响应。α多样性方面，observed species和Chao指数在小麦和菊粉处理中普遍高于初始接种物和空白，但预发酵对α多样性的影响因指数而异；inverse Simpson和Shannon指数的双因素方差分析显示存在显著的基因型×预发酵交互作用，且Shannon指数在预发酵上有显著主效应。总体而言，预发酵并未对α多样性产生一致性的变化，而是表现为指数依赖性效应。
OTU水平分析显示，预发酵对微生物类群的影响是OTU特异性和基因型依赖性的，而非均匀的促进作用。五个代表性OTU中，OTU2（*Parabacteroides distasonis*）在多个小麦处理中丰度较高，双因素方差分析显示基因型主效应及基因型×预发酵交互作用显著，但预发酵主效应不显著。OTU16（*Butyrivibrio crossotus*）在部分小麦处理中相对丰度较高，基因型、预发酵及其交互作用均显著。OTU12（*Kineothrix*）在大多数小麦处理中丰度高于各对照，基因型效应及交互作用显著。OTU29（*Lachnospiraceae*相关）在不同处理间表现出明显但可变的响应，基因型、预发酵及交互作用均显著。OTU48（*Bacteroides eggerthii*）在基因型和预发酵上有显著主效应，但交互作用不显著，表明其响应未表现出明显的基因型依赖性。这些菌属与碳水化合物发酵和SCFA产生相关，其响应可能与消化衍生残渣的组成差异有关，但未进行相关性或底物利用分析，因此应视为关联而非因果机制。
SCFA定量分析显示，菊粉在发酵早期产生较高的总SCFA水平，与快速利用特性一致；而小麦样品的SCFA积累较慢，呈现渐进式发酵动力学特征，所有小麦样品的SCFA浓度随发酵时间逐渐增加，至48 h时多个小麦基因型的总SCFA浓度达约60–70 mM，菊粉约为90 mM。在24 h时间点，基因型对所有SCFA指标（乙酸、丙酸、丁酸和总SCFA）均有显著主效应，且所有SCFA结局均存在显著的基因型×预发酵交互作用，但预发酵的主效应不显著，表明预发酵对SCFA产生的影响方向和幅度因小麦基因型和SCFA组分而异。乙酸是主要SCFA，丙酸和丁酸随发酵时间逐渐积累，可能涉及交叉饲喂作用。由于未包括酵母单独对照且未定量酵母来源碳水化合物，无法区分小麦和酵母来源碳水化合物的贡献；同时未测定分子量分布、阿拉伯木聚糖溶解度及寡糖形成等结构特征，因此机制仍属假说。
讨论部分指出，预发酵引起的组成变化可能影响结肠发酵期间的碳水化合物底物可利用性。观察到Ara/Xyl比值降低及其他单糖比例变化，可能与阿拉伯木聚糖提取性变化、阿拉伯糖富集组分优先损失、谷物内源酶活性、酵母残渣贡献或不同碳水化合物组分相对丰度变化有关。由于*S. cerevisiae*本身降解阿拉伯木聚糖和木聚糖的内在能力有限，该变化不应解释为面包酵母对阿拉伯木聚糖的酶促降解的直接证据。β多样性分析表明，小麦底物（无论生样还是预发酵）均诱导不同于菊粉的群落结构变化，可能反映了小麦来源底物更复杂的结构和组成提供了更广泛的发酵底物，从而支持更多样的微生物类群。特定菌群如*P. distasonis*、*Butyrivibrio crossotus*、*Kineothrix*和*Lachnospiraceae*的相关OTU的响应可能是对残渣中可利用碳水化合物组成差异的反映，但由于缺乏酵母单独对照以及未进行相关分析或底物利用实验，因果机制尚不能确定。SCFA产生模式的差异，特别是预发酵与生样之间的比较，在24 h时表现为显著的基因型×预发酵交互作用，而预发酵主效应不显著，说明预发酵的效应需结合具体基因型来考察。整个研究在简化实验室模型中进行，未模拟面包制作过程的完整工艺参数，因此外推到实际焙烤制品时需谨慎。
研究结论总结如下：本研究证明酵母介导的预发酵与消化衍生小麦残渣组成的变化以及体外肠道微生物发酵的随后改变相关。预发酵提高了Folin–Ciocalteu反应值和抗氧化能力，并与上消化道消化后较低的残留淀粉和蛋白质含量相关。单糖分析显示预发酵小麦样品中阿拉伯糖和木糖的相对比例较低，而葡萄糖相对比例较高，且变化幅度因基因型而异。体外粪便发酵使预发酵小麦样品的微生物群落结构与生小麦相比发生显著变化（通过Bray–Curtis相异度测定，p < 0.001，AMOVA），而α多样性响应有限。包括*Parabacteroides distasonis*、*Butyrivibrio crossotus*和*Kineothrix*在内的多种碳水化合物发酵和SCFA产生菌群表现出分类群和基因型依赖性响应。所有小麦样品均支持SCFA产生，预发酵小麦样品的SCFA积累模式较快速发酵的菊粉对照更为平缓。综上，酵母介导的预发酵可改变小麦组成，并进而影响粪便微生物群落结构和发酵动态，且其响应具有基因型依赖性。
