《Acta Histochemica》：Ultrastructural localization of aquaporin-4 in astrocytic endfeet using immunogold electron microscopy: Implications for cytotoxic brain edema
编辑推荐：
摘要细胞毒性脑水肿是一种危及生命的状况，由代谢或毒性损伤后脑实质细胞（主要是星形胶质细胞）内病理性水分积聚引起。水通道蛋白4（AQP4）是中枢神经系统中主要的水通道蛋白，在星形胶质细胞的血管周围终足膜中高度富集，被认为是介导双向水通量的关键促进因子。尽管已进行了大量的分子和光
摘要
细胞毒性脑水肿是一种危及生命的状况，由代谢或毒性损伤后脑实质细胞（主要是星形胶质细胞）内病理性水分积聚引起。水通道蛋白4（AQP4）是中枢神经系统中主要的水通道蛋白，在星形胶质细胞的血管周围终足膜中高度富集，被认为是介导双向水通量的关键促进因子。尽管已进行了大量的分子和光学显微镜研究，AQP4在终足膜内的纳米级精确分布以及其在细胞毒性水肿发展过程中的空间重组仍然缺乏充分表征。我们在已建立的饮用水中毒诱导细胞毒性水肿小鼠模型脑组织中采用了高分辨率包埋后免疫金电子显微镜方案。成年C57BL/6 J小鼠通过腹腔注射大量水诱导急性全身低渗状态，并在特定时间点进行灌注固定。额顶皮层的超薄切片包埋在亲水性树脂中，使用抗AQP4一抗和偶联超小（1.4 nm）或10 nm金颗粒的二抗进行标记，随后进行银增强以区分两种金颗粒群体。定量分析包括沿星形胶质细胞质膜不同区域的金颗粒密度映射、最近邻距离测量、极性指数以及与内向整流钾通道Kir4.1的双重标记共定位研究。在对照脑中，AQP4免疫反应性呈现显著的极化分布，血管周围终足膜上的金颗粒密度（62.4 ± 4.8个颗粒/μm）比同一细胞面向实质的膜高出12.7倍（4.9 ± 1.2个颗粒/μm；p < 0.001）。双重免疫金标记显示，终足中73.5%的AQP4阳性聚集簇与Kir4.1信号共定位。在诱导细胞毒性水肿后，终足膜上AQP4金颗粒密度在15分钟内下降41%，在60分钟时下降64%（p < 0.001），同时非终足膜标记呈反向增加。极性指数从12.7降至60分钟时的2.1。形态学分析记录到终足横截面积增加3.2倍，以及正交阵列样颗粒聚集簇的渐进性丧失。在合并组分析中，AQP4极化与终足横截面积呈反向相关；然而，组内分析表明这种关联在很大程度上归因于处理组间差异。本研究提供了细胞毒性水肿演变过程中AQP4在星形胶质细胞不同膜区域标记的时间分辨定量超微结构分析。这些发现表明，急性细胞毒性水肿期间血管周围AQP4极化存在显著的时间依赖性丧失，并为未来研究AQP4膜组织变化机制提供了定量框架。
引言
脑水分稳态的维持对正常的神经元功能和生存至关重要。大脑被坚硬的颅骨包裹，因此即使组织含水量轻微增加也可能对其造成极大影响。脑水肿是脑实质内液体的病理性积聚，传统上分为细胞毒性（细胞内）和水肿性（细胞外富含蛋白质）两种类型。细胞毒性水肿是指水从间隙向细胞内间隙的净移动，主要是进入星形胶质细胞，以应对破坏离子平衡的渗透或代谢梯度。该状况发生在多种医疗急症中，包括缺血性卒中、创伤性脑损伤、急性肝衰竭和水中毒。当严重发生时，细胞毒性肿胀会导致颅内压升高、疝综合征和死亡，但目前尚无直接减轻星形胶质细胞水进入的靶向药物治疗（Getachew et al., 2022a）。
星形胶质细胞是细胞毒性水肿中发生灾难性肿胀的主要细胞类型。这些胶质细胞的一个显著特征是形成特化的层状突起，称为终足，完全包裹脑微血管并在软脑膜处形成限制性屏障。血管周围终足膜是血液与脑实质之间水分子移动时遇到的第一个界面（T Sun, 2022）。单一的水通道蛋白——水通道蛋白4（AQP4）在这些膜区域中以异常高密度表达，主要以两种主要亚型M1和M23存在，后者组装成称为正交颗粒阵列（OAPs）的超分子晶体晶格，可通过冻裂电子显微镜观察到。AQP4的策略性定位使其被认为是有氧渗透驱动的水通量跨越血脑屏障界面的主要通路（Chow et al., 2024）。
光镜免疫组织化学和转基因报告基因研究已证明，在健康脑中，AQP4免疫反应性强烈集中在血管周围，形成鹅卵石样模式，而实质星形胶质细胞突起则呈现较弱的弥散标记。这种极化对神经元活动期间的生理水通量、钾缓冲（Ramani et al., 2023）和脑体积调节至关重要。利用AQP4敲除小鼠的功能研究证实，该通道在细胞毒性水肿模型（包括水中毒和缺血性卒中）中促进脑肿胀。令人 paradoxically的是，同一AQP4缺失动物在水肿性水肿模型中表现出加重的脑肿胀，揭示了AQP4取决于水移动驱动力的双重作用。
大量文献已在光镜和生化水平上表征了AQP4表达；然而，尚缺乏一种全面的超微结构定量分析，同时映射AQP4沿星形胶质细胞质膜不同区域的纳米级精确分布并追踪细胞毒性水肿起始过程中发生的动态变化（Zhang et al., 2022）。冻裂研究已优雅地证明了终足膜中OAPs的存在及其在缺血期间的耗竭，但这些数据并未直接鉴定蛋白质种类为AQP4，也未量化再分布的程度。免疫电镜在分子特异性和形态学背景方面具有优势，但大多数既往研究为定性研究，采用渗透性和分辨率有限的包埋前方法，或仅检查稳态条件（Liu et al., 2024a）。
多个关键问题仍未得到解答。首先，在完整脑中，血管周围终足与面向实质的星形胶质细胞膜中AQP4分子的绝对密度和纳米级聚集模式是什么？其次，急性渗透挑战后AQP4膜标记和极化变化的速度有多快，这些变化与星形胶质细胞肿胀在时间上如何关联？第三，AQP4极化变化与肿胀期间终足膜表面积扩张的相关程度如何？第四，AQP4与其他功能偶联蛋白质（Bai et al., 2024）——如内向整流钾通道Kir4.1——的物理结合在观察到的AQP4极化丧失过程中是否持续存在，这种相互作用能否提供机制见解？解决这些空白需要严格的时间分辨定量免疫金电子显微方法。
本研究的主要目标是建立高分辨率定量免疫金电子显微镜方案，以映射小鼠脑皮质星形胶质细胞中AQP4的亚细胞分布，并定义其在全身水中毒诱导急性细胞毒性水肿演变过程中的空间重组。我们假设：(1) 在生理条件下，AQP4以有序聚集簇集中在血管周围终足膜中，且几乎被排除在非终足质膜之外；(2) 诱导有利于水净流入星形胶质细胞的渗透梯度会产生血管周围AQP4极化的快速降低，并伴随非终足膜区域的标记改变；(3) AQP4极化变化的幅度与终足肿胀的严重程度相关；(4) 在水肿过程中AQP4与Kir4.1之间的空间偶联部分解离（Nagelhus et al., 2004）。为检验这些假设，我们在LR White包埋组织上开发了包埋后双标记免疫金技术，并结合详细的立体学定量、时间过程分析和形态学相关性分析。
章节摘要
实验设计
本研究共使用78只成年雄性C57BL/6 J小鼠（10–12周龄，25–30 g）。对于主要免疫金分析，36只小鼠分为三组：假手术对照组（n = 12）、水中毒15分钟组（n = 12）和水中毒60分钟组（n = 12）。其中每组10只动物纳入定量免疫金分析，每组2只动物保留用于超微结构筛选和定性评估。另有一组24只动物（n = 8
生理条件下AQP4在血管周围星形胶质细胞终足中高度富集
假手术小鼠额顶皮层的免疫金电子显微镜显示AQP4呈显著的极化分布。指示AQP4分子的金颗粒密集排列在血管周围星形胶质细胞终足直接面向内皮基底膜的质膜上（图1，图2A、B）。相比之下，同一星形胶质细胞突起在面向实质神经网或接触突触的部位，其质膜上仅呈现稀疏标记（Hussain
讨论
本研究提供了细胞毒性脑水肿最早期阶段AQP4在星形胶质细胞终足中定位及其动态重组的全面定量超微结构分析。利用高分辨率包埋后免疫金电子显微镜，我们证明AQP4不仅富集于终足膜，而且以离散的超分子聚集簇形式组织，其相对于星形胶质细胞其余表面面积的极性比超过12:1（Getachew
生物学意义
极化AQP4标记的快速丧失对于理解细胞毒性水肿期间星形胶质细胞水通道表达的空间组织具有重要意义。广泛接受的模型提出AQP4在细胞毒性水肿期间促进渗透驱动的星形胶质细胞水流入；因此，AQP4缺失在水中毒和缺血性卒中模型中具有保护作用。观察到的AQP4极化丧失的功能后果无法仅从定位数据确定。
结论
本研究显示，正常小鼠皮质中AQP4相关的免疫金标记在血管周围星形胶质细胞终足中呈显著极化，而在急性水中毒后这种极化逐渐减弱。终足标记降低伴随非终足标记增加、AQP4相关金颗粒的空间聚集减少、AQP4与Kir4.1信号之间纳米级邻近关系改变以及星形胶质细胞终足渐进性肿胀。由于AQP4变化的
CRediT作者贡献声明
韩红艳：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，调查研究，形式化分析，概念构思。王军：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，方法论，调查研究，形式化分析，数据管理，概念构思。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能影响本文报道工作的竞争性经济利益或个人关系。
韩红艳|王军
