β2-微管蛋白点突变赋予新拟盘多毛孢菌对多菌灵的抗性

《Advanced Agrochem》：Point mutations in β 2-tubulin endow Neopestalotiopsis clavispora with resistance to carbendazim

　　

研究人员首次报道了采自中国江苏茶树灰枯病的拟盘多毛孢样真菌中新拟盘多毛孢菌（Neopestalotiopsis clavispora）对多菌灵（carbendazim）的抗性，抗性频率为20%。研究人员在β2-微管蛋白（β2-tubulin）中鉴定出三个点突变（E197K、E197A和F199Y），并证实其赋予高水平抗性（抗性因子RF > 200，最小抑制浓度MIC ≥ 200 μg/mL）；基因替换实验进一步证明任一突变单独即足以导致抗性表型。分子对接揭示多菌灵与突变体β2-微管蛋白结合亲和力降低，为抗性提供结构基础。抗性分离株在菌丝生长、产孢或致病力上无适合度代价，且对苯醚甲环唑（phenamacril）、咪鲜胺（prochloraz）、咯菌腈（fludioxonil）或戊唑醇（tebuconazole）无交叉抗性。

研究背景与立项依据

茶树灰枯病由拟盘多毛孢样真菌（Pestalotiopsis-like fungi，含Neopestalotiopsis、Pestalotiopsis和Pseudopestalotiopsis三属）引起，可致茶叶减产达50%并降低品质。多菌灵（carbendazim，MBC）属苯并咪唑类广谱杀菌剂，通过干扰微管蛋白（tubulin）合成抑制菌丝生长与分生孢子萌发，但因单靶标特性抗药风险高，已在Botrytis cinerea、Fusarium graminearum等多种植物病原真菌中检出β-微管蛋白点突变介导的抗性。此前Pseudopestalotiopsis camelliae与Pestalotiopsis longiseta田间已出现MBC抗性，但Neopestalotiopsis clavispora对多菌灵的抗性状况尚不明确。该研究由Wenyong Shao、Changjun Chen等学者完成，发表于《Advanced Agrochem》，旨在明确N. clavispora对MBC的敏感性、抗性机制及适合度代价，为茶树灰枯病科学用药提供依据。

主要关键技术方法

研究人员于2022年从江苏江宁、溧水、溧阳等茶园采集典型灰枯病叶分离85株拟盘多毛孢样真菌；以ITS、EF-1α与β₂-tubulin（TUB）多基因串联构建贝叶斯系统发育树进行物种鉴定；采用判别浓度（0.2与100 μg/mL）测定MBC敏感（MBC^S）与抗性（MBC^R）表型并计算EC₅₀与MIC及抗性因子RF；以Spearman秩相关分析MBC与phenamacril、prochloraz、fludioxonil、tebuconazole交叉抗性；评估菌丝生长、产孢量与接种白叶一号茶苗叶片致病力以测适合度；PCR测序比对β₂-tubulin（G7054_g7568）编码区；通过同源重组将突变ORF回替入敏感株FS5原生质体构建替换突变体；利用AlphaFold 3同源建模野生与三种突变蛋白并以AutoDock Vina做分子对接。

研究结果

3.1 病原体鉴定为拟盘多毛孢样真菌：经形态学与ITS系统发育确认为Pestalotiopsis-like fungi。

3.2 N. clavispora对多菌灵的敏感性：85株中17株MBC^R（MIC >100 μg/mL），68株MBC^S（MIC=0.2 μg/mL），抗性频率20%；选6株MBC^R测EC₅₀为8.46–192.03 μg/mL（RF_EC50 340–7712），FS5为0.0249 μg/mL，J1/J2为高抗，J16/M33/M101/J3为极高抗。

3.3 进化分析：ITS+TUB+EF-1α串联贝叶斯树显示17株MBC^R与FS5均归入N. clavispora单系枝（后验概率≥0.90，ASDSF=0.0286）。

3.4 交叉抗性测定：MBC^R与MBC^S对phenamacril、prochloraz、fludioxonil、tebuconazole的EC₅₀无显著差异，Spearman相关不显著（P>0.05），无交叉抗性。

3.5 菌丝生长、产孢与毒力：MBC^R株菌丝生长、产孢量、茶叶病斑面积与FS5比无统计差异（Tukey P<0.05），无适合度代价。

3.6 N. clavispora微管蛋白进化：注释出α/β/γ三类微管蛋白，NcTUBB2（G7054_g7568）与F. graminearum等β₂同源聚枝。

3.7 β-微管蛋白序列分析：仅G7054_g7568变异，密码子197与199突变——E197A（A1097C）、E197K（G1096A）、F199Y（T1103A）；N. clavispora第197/199位对应F. graminearum第198/200位。

3.8 突变赋予MBC抗性：基因替换突变体NcTub^E197K、NcTub^E197A、NcTub^F199Y在FS5背景下获得与田间MBC^R同等抗性，证单点突变足致抗性。

3.9 同源建模与分子对接：野生NcTUBB2与MBC结合能-7.6 kcal/mol，突变体E197A/E197K/F199Y分别为-6.8/-6.7/-6.7 kcal/mol；野生型MBC与Glu-3、Asn-6成氢键，E197A丢失氢键，E197K/F199Y改与Met-1、Thr-135、Val-63成键，结合口袋构象改变降低亲和力。

讨论与结论翻译

茶树为中国重要经济作物，灰枯病致产销受损，多菌灵是主控药剂但抗性问题突出。研究人员监测到N. clavispora田间MBC抗性频率20%且含极高抗株，抗性株适合度无代价、无交叉抗性，故N. clavispora对MBC抗性强风险高，需持续监测并与phenamacril或prochloraz等不同机理药剂混用或轮用。系统发育显示Neopestalotiopsis与Pseudopestalotiopsis近缘而与Pestalotiopsis疏远，17株MBC^R分两亚群。β₂-tubulin的E197A/K与F199Y（对应他种E198/K与F200Y）分别介导高抗与中抗，保守于多种病原真菌；基因替换与对接从遗传与结构两面确证突变降亲和力机制。综上，该研究阐明N. clavispora对多菌灵的抗性现状、进化背景、靶标突变（E197K、E197A、F199Y）因果性及无适合度代价特征，为茶树灰枯病抗性治理与杀菌剂科学使用提供方向，并增进对真菌进化与药剂抗性机制的理解。