RP-UHPLC/MS/MS技术揭示了他汀类药物对人类血浆中游离单羟基甾醇和生育酚成分的影响

《Analytica Chimica Acta》：RP-UHPLC/MS/MS reveals statin-induced alterations in profiles of free monohydroxy sterols and tocopherols in human plasma

　　

摘要

背景

他汀类药物是全球使用最广泛的降胆固醇药物。反相超高效液相色谱与串联质谱（RP-UHPLC/MS/MS）联用能够分析脂质异构体，而化学衍生化处理可以提高离子化效率。本文探讨了建立一种用于人血浆中甾醇和生育酚的验证定量方法的需求，以及该方法在揭示他汀类药物对脂质组成（包括异构体水平）影响中的应用。

结果

我们开发了一种基于3-(氯磺酰)苯甲酸化学衍生化的高通量RP-UHPLC/MS/MS方法，并采用负离子模式下的多反应监测（MRM）技术。经过优化和验证的该方法使用了8种内标（IS），能够定量检测18种甾醇和两种生育酚（α-生育酚和γ-生育酚）。通过对41名接受他汀治疗和41名未接受他汀治疗的受试者的人血浆样本进行脂质组学分析，获得了与胆固醇相关的脂质的全面信息。由于各种异构体在生物学上的重要性不同，分离这些异构体是一个关键环节。

意义

该方法能够高灵敏度、高选择性地定量分析游离甾醇和生育酚及其异构体结构，这对于生物学解读至关重要。单变量和多变量统计分析表明，接受他汀治疗的受试者体内内源性游离甾醇和α-生育酚存在统计学上的显著变化，而外源性游离甾醇则没有显著变化。

引言

甾醇是一类非极性脂质，在真核生物中广泛存在，可通过甲羟戊酸途径内源合成或通过饮食摄入。在哺乳动物中，最丰富的甾醇代表是胆固醇，它对细胞膜的结构和功能至关重要，同时也是其他脂质（如类固醇、维生素D、氧甾醇和胆汁酸）的主要前体[1]、[2]、[3]、[4]。除了甾醇外，维生素E也是哺乳动物脂质代谢中另一种重要的非极性分子。维生素E在膜中含量丰富，作为抗氧化剂起着保护甾醇和多不饱和脂肪酸免受氧化损伤的作用[5]、[6]。

胆固醇及其相关物质的紊乱与多种病理状态有关，例如高脂血症[7]、[8]、动脉粥样硬化[7]、[9]、糖尿病[7]、[10]、阿尔茨海默病[7]和癌症[12]、[13]。针对这些疾病的治疗和预防策略之一是抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶，主要在肝组织中发挥作用。他汀类药物通过这种机制起效，已被证明可以降低心血管疾病（CVD）的风险，并显著降低人体内的低密度脂蛋白（LDL）水平[14]、[15]、[16]。最近的研究表明，他汀类药物具有多效性，可能在痴呆症、多发性硬化症、骨质疏松症和多种癌症等疾病的治療中具有潜在应用[17]、[18]。

多种分析技术可用于测定生物样本中的甾醇浓度，其中最精确的方法是质谱（MS）。然而，许多甾醇存在异构体，这使得仅使用MS进行鉴定和定量颇具挑战性[19]、[20]、[21]。因此，在MS检测之前需要先进行色谱分离。传统上，甾醇分析采用气相色谱与MS联用的方法，但该方法需要复杂的样品前处理过程，包括衍生化步骤[22]、[23]、[24]、[25]。目前，越来越多的研究采用超高效液相色谱（UHPLC）[26]、[27]、[28]、[29]、[30]。

人血浆中的甾醇以游离形式和酯化形式存在，由于其浓度范围广且易发生原位降解[26]、[28]、[31]，测定其浓度较为困难。在实际应用中，通常检测总甾醇（游离和酯化形式），但这会导致敏感的甾醇品种降解，从而掩盖其原始信息[26]、[32]、[33]、[34]。同样，生育酚也容易氧化，在提取和分析过程中需要小心处理[35]、[36]。

目前，脂质组学在准确解析复杂血浆样本中的游离单羟基甾醇和生育酚异构体方面仍面临挑战。此外，脂质组学研究主要集中在胆固醇衍生物（如氧甾醇和胆汁酸）及维生素E（主要是α-生育酚）上[37]、[38]、[39]、[40]、[41]。因此，目前缺乏针对游离非胆固醇甾醇和其他形式生育酚的准确定量方法，而这些指标对于代谢性疾病和心血管疾病的生物标志物发现至关重要[41]、[42]、[43]、[44]。本研究旨在开发一种高通量、高灵敏度、高选择性的方法来检测含有一个羟基的游离甾醇和生育酚。该方法已用于NIST标准参考物质1950的定量分析，并将结果与文献数据进行比较。最后，研究了接受他汀治疗和未接受他汀治疗的受试者的甾醇和生育酚谱型，以评估他汀类药物对其浓度的影响。

章节摘录

化学试剂和标准品

乙腈（ACN）、1-丁醇（BuOH）、甲醇（MeOH）、2-丙醇（IPA）、己烷、甲酸（均为LC/MS梯度级）和碳酸铵（≥30.0% NH₃）购自Honeywell（美国北卡罗来纳州夏洛特）。甲酸铵（用于MS，≥99.0%）、3-(氯磺酰)苯甲酸（95%）（Cl-SBA）和吡啶（用于HPLC，≥99.9%）购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯），LiChrosolv氯仿（用2-甲基-2-丁烯稳定）购自Merck（德国达姆施塔特）。

RP-UHPLC/MS/MS方法的优化

本研究的主要目标是开发一种高通量方法，用于靶向分析甾醇和三种生育酚，重点在于分离异构体。分离方法的初始条件借鉴了我们之前的研究[30]并进行了进一步优化。

我们使用了一种包含15种脂质的衍生化标准混合物（STD-Mix，见表S1）来优化RP-UHPLC/MS/MS参数，同时评估了流动相组成和梯度程序。

结论

本研究采用RP-UHPLC/MS/MS结合3-(氯磺酰)苯甲酸化学衍生化技术，验证了一种用于游离单羟基甾醇和生育酚定量分析的方法。所得定量结果与先前报道的值相当。该方法的显著优势在于其对异构体的色谱分辨能力，这对于准确的生物学解析至关重要。随后将该方法应用于接受他汀治疗的受试者和未接受他汀治疗的受试者。

CRediT作者贡献声明

Yasmin Kadyrbekova：负责撰写初稿、数据可视化、方法学设计、实验实施和数据整理。Michal Hol?apek：负责审稿和编辑、项目监督、资金筹集及概念构思。Lenka Dubská：负责实验实施。Anna Taylor：负责数据可视化。Ond?ej Peterka：负责撰写、审稿和编辑、方法学设计及实验实施。Robert Jirásko：负责审稿和编辑、项目监督及概念构思。

遵守伦理标准

所有参与者均签署了知情同意书，伦理委员会也批准了血液采集。

作者声明不存在任何可能影响本论文研究的利益冲突。

数据可根据需求提供。

利益冲突声明

作者声明没有任何已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了欧洲研究委员会项目编号101095860的支持。

作者感谢Dana Galuszková（捷克奥洛穆茨大学医院输血中心）提供用于方法验证的生物样本，以及Bohuslav Melichar教授（捷克奥洛穆茨帕拉茨基大学和大学医院）协助获取生物样本的伦理批准。

Yasmin Kadyrbekova|Ond?ej Peterka|Robert Jirásko|Lenka Dubská|Anna Taylor|Michal Hol?apek

捷克帕尔杜比采大学化学技术学院分析化学系