《Applied Food Research》：Molecular Characterization and Functional Activities of Bioactive Peptides from Panchali Sheep Milk Fermented with
Lacticaseibacillus rhamnosus MTCC 25516 and
Saccharomyces cerevisiae WBS2A
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本研究探讨了由鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus，M9，MTCC 25516）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，WBS2A，MG101828）联合发酵的潘查利（Panchali）羊奶所产生的生物
本研究探讨了由鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus，M9，MTCC 25516）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，WBS2A，MG101828）联合发酵的潘查利（Panchali）羊奶所产生的生物活性肽的抗氧化及抗糖尿病潜力。发酵过程在30°C下进行，并在0、12、24、36及48小时时间点进行测定。在48小时时观察到最大活性，其中抗氧化活性（ABTS自由基清除率）为28.62%，α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率分别为71.19%和65.90%。研究人员通过改变接种量和孵育时间对蛋白水解作用进行了优化，在2.5%接种量并于48小时后达到最大活性（6.31 mg/mL）。发酵羊奶显著抑制了脂多糖（LPS）诱导的RAW 264.7细胞中细胞毒素和活性氧（ROS）的产生，提示其具有抗炎作用。研究人员利用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）验证了蛋白质的结构和分子变化，揭示了蛋白质网络结构的变化。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）显示在10–85 kDa之间存在显著蛋白条带，而渗透液中未检测到条带。相比之下，二维凝胶电泳在15–70 kDa分子量范围内定位了35个不同的蛋白斑点。研究人员进一步采用反相高效液相色谱（RP-HPLC）和MASCOT软件分析了水溶性提取物，并通过BIOPEP数据库验证了所得序列的抗氧化和抗糖尿病活性。值得注意的是，ITMPLW肽的分子对接研究显示其与消化酶具有高结合亲和力，证实了其多功能生物活性。总体而言，发酵潘查利羊奶是一种具有强抗氧化和抗糖尿病潜力的新型肽来源。
**论文解读：基于鼠李糖乳酪杆菌与酿酒酵母共发酵的潘查利羊奶生物活性肽的分子特性及功能活性研究**
**一、研究背景与目的**
氧化应激在糖尿病等慢性疾病的发生发展中起着关键作用，因此控制氧化应激对糖尿病管理具有重要意义。乳蛋白是生物活性肽（Bioactive Peptides, BAPs）的重要前体物质，这些通常由2–20个氨基酸残基组成、分子量低于6 kDa的肽段可通过蛋白水解作用释放，且比游离氨基酸或更长肽链更易被吸收，在体内循环后发挥多种生理调节功能。在众多乳源中，羊奶因其高蛋白含量和产生生物活性肽的潜力而备受关注。羊奶富含共轭亚油酸（Conjugated Linoleic Acid, CLA）、极性脂质及维生素A和D，具有优于牛乳的营养特性。然而，目前关于利用特定微生物组合发酵印度地方品种羊奶以释放功能性生物活性肽的研究仍较为有限。基于此，本研究旨在利用鼠李糖乳酪杆菌（Lacticaseibacillus rhamnosus, M9, MTCC 25516）与酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae, WBS2A, MG101828）联合发酵潘查利（Panchali）羊奶，系统评估其发酵产物的抗氧化、抗糖尿病、抗炎及免疫调节潜力，并通过分子对接分析阐释其生物活性肽的功能机制。该研究论文发表于《Applied Food Research》。
**二、主要技术方法**
研究人员采用多种关键技术方法开展研究。菌株来源方面，L. rhamnosus（M9, MTCC 25516）获自印度古吉拉特邦Anand的SMC乳业科学学院乳品微生物学系培养物保藏中心，S. cerevisiae（WBS2A, MG101828）由印度梅加拉亚邦图拉东北山大学农村发展与农业生产系提供；羊奶采自印度Anand地区小规模非商业来源的潘查利品种。主要技术方法包括：邻苯二甲醛（O-phthalaldehyde, OPA）法评估蛋白水解活性；十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和二维凝胶电泳（2D-GE）分析蛋白质谱；傅里叶变换红外光谱（FTIR）表征蛋白质二级结构变化；共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察蛋白质微观结构；反相高效液相色谱（RP-HPLC）分离纯化肽段；液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）结合ProteinPilot和Mascot软件鉴定肽序列；BIOPEP数据库验证肽段生物活性；ABTS法评估抗氧化活性；α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制实验评估抗糖尿病活性；以脂多糖（LPS）刺激的RAW 264.7巨噬细胞模型评估抗炎和细胞保护作用；AutoDock和GalaxyPepDock等工具进行分子对接分析。
**三、研究结果**
**3.1 发酵羊奶的抗氧化活性评估**
研究人员采用ABTS自由基清除实验评估发酵羊奶的抗氧化活性。结果表明，随着发酵时间延长，抗氧化活性呈进行性增加趋势，在48小时达到最高值28.62%，较初始时间点（0小时，1.12%）有显著提升（p < 0.05），呈现明显的时间依赖性增强特征。
**3.2 发酵羊奶的抗糖尿病特性评价**
研究人员通过α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制实验评估发酵羊奶的抗糖尿病活性。结果显示，两种酶的抑制活性均随发酵时间延长而显著增强（p < 0.05），在48小时发酵后α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶抑制率分别达到峰值71.19%和65.90%，表明延长发酵时间促进了具有酶抑制活性的生物活性代谢物的生成与积累。
**3.3 发酵羊奶的蛋白水解评估**
研究人员采用OPA法测定了不同接种量（1.5%、2.0%、2.5%）和不同发酵时间下的蛋白水解活性。结果显示，蛋白水解活性随发酵时间显著增加（p < 0.05），在2.5%接种量发酵48小时后达到最大值6.31 mg/mL，表明接种量与发酵时间的协同作用对蛋白水解效率具有显著影响。
**3.4 发酵羊奶的SDS-PAGE分析**
SDS-PAGE分析显示，未发酵羊奶在15–85 kDa范围内显示完整蛋白质条带，而发酵羊奶的蛋白条带明显减少且局限于15–85 kDa范围，表明发酵过程中微生物蛋白酶发挥了显著的蛋白降解作用。值得注意的是，渗透液样品中未检测到任何蛋白质条带，说明超滤膜有效截留了较大分子量蛋白质。
**3.5 发酵羊奶的二维凝胶电泳分析**
二维凝胶电泳（2D-GE）结合等电聚焦技术（pH 3–10）对发酵羊奶蛋白进行分离，共定位到35个蛋白质斑点，分子量分布集中在15–70 kDa范围内。这一结果与SDS-PAGE分析相互印证，证实发酵导致了高分子量蛋白质向低分子量肽段的有效转化。
**3.6 基于RPLC/MS的肽段鉴定与结构分析**
研究人员通过LC-MS/MS对二维凝胶电泳分离的蛋白斑点进行胰蛋白酶酶解后分析，并经Mascot和ProteinPilot软件搜索鉴定出6条肽段序列。经PeptideRanker评分和BIOPEP数据库比对验证，这些肽段被预测为非毒性且具有潜在生物活性。其中，肽段ITMPLW具有最高的PeptideRanker评分（0.85967），被优先选为候选肽进行后续分析。
**3.7 超滤组分的RP-HPLC分析及活性评价**
研究人员对发酵羊奶的水溶性提取物进行3 kDa和10 kDa超滤分级，并采用RP-HPLC分析各组分的肽谱特征。结果表明发酵显著增加了肽段的生成。在生物活性评估中，3 kDa截留液表现出最高的抗氧化活性（43.47%），而10 kDa渗透液表现出最强的α-淀粉酶抑制活性（72.99%）和α-葡萄糖苷酶抑制活性（75.61%），提示低分子量肽段在抗糖尿病活性中发挥关键作用。
**3.8 发酵羊奶的傅里叶变换红外光谱分析**
FTIR分析显示，发酵羊奶在1639 cm?1处（酰胺I区，主要归因于肽键的C=O伸缩振动）的吸收峰显著增强，并在1620–1640 cm?1范围内（与β-折叠结构相关）的信号明显增强，同时α-螺旋结构减少。这些光谱变化证实了发酵过程中蛋白质发生了解折叠和结构重组，形成了富含低分子量肽段的组分。
**3.9 发酵羊奶的炎症抑制活性**
研究人员采用LPS诱导的RAW 264.7巨噬细胞炎症模型评估发酵羊奶的抗炎作用。在0.25和0.5 mg/mL低浓度下，发酵羊奶表现出良好的生物相容性（细胞活力约100%）；在0.5 mg/mL浓度下可显著降低促炎细胞因子TNF-α和IL-1β的产生，1 mg/mL浓度下对IL-6表达的抑制效果更为显著，呈现明确剂量依赖性（p < 0.05）。此外，发酵羊奶处理可将LPS诱导的晚期凋亡细胞群从40.5%降至8.80%，并将细胞内活性氧（ROS）水平从44%降至13.5%，显示出强效的细胞保护和抗氧化应激能力。
**3.10 分子对接研究**
分子对接分析揭示了肽段ITMPLW与三种靶酶的潜在结合模式：与人胆汁盐激活脂肪酶（hBAL, PDB ID: 1F6W）通过His168和Lys210形成氢键；与人麦芽糖酶-葡糖淀粉酶（hMGA, PDB ID: 3CTT）通过Thr198、Thr199、Thr205和Lys474相互作用；与人胰α-淀粉酶（hPAM, PDB ID: 3BAI）通过Val353、His304、Asp299和Thr162结合。其中，ITMPLW与hBAL表现出最高的结合亲和力。分子对接结果与酶活性抑制实验结果相互印证，支持该肽段作为多功能生物活性肽的潜在应用价值。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，发酵时间与接种量是影响羊奶蛋白水解程度和生物活性肽释放的关键因素。本研究中观察到的抗氧化和抗糖尿病活性随发酵时间延长而增强的趋势，与已有关于发酵羊奶和发酵骆驼奶的研究结果相吻合。超滤分级实验证实，低分子量肽段（特别是10 kDa渗透液组分）在酶抑制活性中发挥主要作用，这可能与其中富含疏水性氨基酸（如亮氨酸、脯氨酸）的短链肽段有关。分子对接结果为ITMPLW肽段与消化酶之间形成稳定复合物提供了结构层面的证据。
研究结论表明，利用鼠李糖乳酪杆菌与酿酒酵母联合发酵潘查利羊奶，在30°C、2.5%接种量条件下发酵48小时，可获得具有显著抗氧化（28.62%）、α-淀粉酶抑制（65.90%）和α-葡萄糖苷酶抑制（71.19%）活性的生物活性肽。研究通过多种分析手段系统证实了发酵羊奶中生物活性肽的生成及其抗炎、抗氧化和抗糖尿病潜力，为开发功能性食品、营养保健品和治疗性产品提供了新的肽源。然而，研究结果仍需要进一步的体内（in vivo）实验和临床研究来验证其功效并确保实际应用中的安全性。
