《Aquatic Toxicology》：Integrated cellular, physiological, and transcriptional responses of
Mytilus galloprovincialis to environmentally relevant OIT and DCOIT co-exposure
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摘要翻译：异噻唑啉酮类杀生剂（isothiazolinone biocides）在水生环境中作为新兴污染物（emerging contaminants）日益受到关注。其中，2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（2-n-octyl-4-isothiazolin-3-
摘要翻译：异噻唑啉酮类杀生剂（isothiazolinone biocides）在水生环境中作为新兴污染物（emerging contaminants）日益受到关注。其中，2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（2-n-octyl-4-isothiazolin-3-one, OIT）与4,5-二氯-2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（4,5-dichloro-2-n-octyl-4-isothiazolin-3-one, DCOIT）可能在受纳水体中共存，然而二者对海洋生物的联合效应尚不明确。研究人员将地中海贻贝（*Mytilus galloprovincialis*）暴露于OIT（2.81 μg L?1）、DCOIT（1 μg L?1）及其混合物（MIX）中14天，暴露浓度选取自环境相关水平。研究评估了细胞活力（cell viability）、调节性体积减小（regulatory volume decrease, RVD）、血细胞吞噬活性（haemocyte phagocytic activity）以及氧化应激、外源物质代谢和炎症相关基因的表达情况。总体而言，细胞活力保持较高水平，但OIT显著降低了血细胞膜完整性和溶酶体稳定性。所有暴露条件均改变了细胞体积调节能力，并显著降低了血细胞吞噬活性，其中联合暴露组的降幅最为显著。转录分析显示，锰超氧化物歧化酶（MnSOD）、铜/锌超氧化物歧化酶（Cu/ZnSOD）、CYP4Y1、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和白细胞介素-17（IL-17）在各组织中均发生广泛调控，且MIX组通常表现出最强烈的响应。在消化腺中，CYP4Y1表达较对照组升高4.13倍，MnSOD和TNF-α分别升高3.33倍和3.50倍。低浓度OIT与DCOIT联合暴露与贻贝整合的细胞、渗透调节、免疫及转录响应相关。这些发现表明，有限的细胞毒性并不排除显著的亚致死效应，并强调将异噻唑啉酮类化合物作为共存污染物而非单一化合物进行生态风险评估的重要性。
论文解读文章
**一、研究背景与意义**
异噻唑啉酮类化合物（isothiazolinones）是一类广谱杀生剂，因其噻唑环对细胞巯基（thiol）基团具有高反应活性，能够通过破坏微生物关键代谢酶的功能来抑制其生长，故被广泛用作防腐剂和抗菌剂，应用于工业、医疗及民用产品中。然而，该作用机制本质上缺乏选择性，对非靶标水生生物同样构成潜在风险。随着数十年的持续使用，这类化合物已在水生环境中逐渐蓄积，并作为新兴污染物受到关注。其中，2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（OIT）和4,5-二氯-2-正辛基-4-异噻唑啉-3-酮（DCOIT）是商业上应用最广泛、用量最大的两种异噻唑啉酮。DCOIT以商品名Sea-Nine 211广泛用于船舶防污涂料，而OIT则常用于建筑和工业涂料的罐内防腐。二者均可从处理过的表面淋溶进入污水系统和受纳水体。环境监测已在废水、河流、地表水和沿海区域检出这两种化合物，浓度一般为μg L?1量级。例如，OIT在污水处理厂进水中的浓度可达2.81 μg L?1，河流水体中的最高浓度在污水处理厂上游达29.1 μg L?1、下游达43.2 μg L?1。早期研究认为这类化合物在水中快速降解，半衰期仅数天；但近期研究表明，DCOIT在自然地表水中的光降解半衰期可达20.9天，且在持续输入条件下可表现为“假持久性”（pseudo-persistent）污染物。同时，DCOIT的转化产物仍可能保留长期慢性毒性。监管评估将OIT和DCOIT均列为对水生生物高危害的物质，DCOIT的毒性通常更高——对鱼类的96 h半数致死浓度（LC??）分别为OIT约47 μg L?1和DCOIT约2.7 μg L?1，对大型蚤（*Daphnia*）的48 h半数效应浓度（EC??）分别约为107 μg L?1和5.2 μg L?1。地中海贻贝（*Mytilus galloprovincialis*）作为滤食性底栖生物，是生态毒理学研究中广泛使用的指示物种，其对水环境中的外源化合物高度敏感，血细胞和消化腺细胞是反映污染物胁迫的敏感细胞群体。已有研究表明单一OIT或DCOIT暴露可导致贻贝吞噬活性受损、抗氧化系统改变及免疫相关基因表达失调，但迄今尚无研究同时考察OIT与DCOIT在低μg L?1浓度联合暴露下对贻贝细胞、渗透调节、免疫和转录水平的综合影响。该研究正是针对这一知识空白而开展，论文发表在《Aquatic Toxicology》。
**二、主要技术方法**
研究样本采集自意大利墨西拿法罗湖（Faro Lake, Messina, Italy）商业贻贝养殖场的200只地中海贻贝（壳长5.97 ± 0.23 cm，壳宽2.98 ± 0.33 cm），在实验室自然光周期、过滤海水条件下驯养后，随机分配至对照组、OIT组（2.81 μg L?1）、DCOIT组（1 μg L?1）及二者混合组（MIX）四个实验组，每组两个水族箱、每箱25只，持续暴露14天，海水每48小时完全更换并重新添加目标化合物。研究采用台盼蓝（Trypan Blue, TB）排斥法和中性红（Neutral Red, NR）保留法分别评估血细胞和消化腺细胞活力；通过调节性体积减小（RVD）实验评估消化腺细胞在低渗刺激下的体积调节能力；利用酵母菌吞噬实验评估血细胞吞噬活性；采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测消化腺、鳃和血淋巴中氧化应激（MnSOD、Cu/ZnSOD）、外源物代谢（CYP4Y1）及炎症（TNF-α、IL-17）相关基因的表达水平，以18S rRNA为内参基因，以2?ΔΔCt法计算相对表达量。
**三、研究结果**
**3.1 血细胞活力**
暴露14天后，台盼蓝排斥法显示对照组血细胞活力为99.87 ± 0.13%，OIT组显著降至95.46 ± 0.92%（p < 0.01），DCOIT组和MIX组分别为97.80 ± 0.99%和97.74 ± 0.70%，与对照组无显著差异。中性红保留法结果趋势一致：OIT组溶酶体膜稳定性显著下降至93.17 ± 1.71%（p < 0.05），DCOIT组（95.01 ± 0.77%）和MIX组（96.33 ± 0.67%）与对照组（97.73 ± 2.14%）无显著差异。两种方法共同表明，各处理组血细胞活力总体较高，但OIT对血细胞膜完整性和溶酶体稳定性产生了可测量的影响，提示其引发早期细胞应激而非明显的细胞毒性。
**3.2 消化腺细胞活力**
台盼蓝排斥法检测显示，所有处理组消化腺细胞活力均接近100%，各组间无显著差异（对照组99.72 ± 0.14%，OIT组99.83 ± 0.08%，DCOIT组99.34 ± 0.15%，MIX组99.45 ± 0.04%）。中性红保留法则检测到细微但显著的差异：对照组为100 ± 0.00%，OIT组显著降至97.29 ± 0.71%（p < 0.01），DCOIT组（98.57 ± 0.30%）和MIX组（98.58 ± 0.33%）与对照组无显著差异。结果表明消化腺细胞整体保持高活力，但OIT暴露在亚细胞水平引起了溶酶体功能轻度损伤，消化腺组织可能具有更高效的解毒机制。
**3.3 调节性体积减小（RVD）响应**
在低渗溶液刺激下，对照组细胞出现典型的快速肿胀期和随后的渐进恢复期。相比之下，所有处理组（OIT、DCOIT和MIX）的细胞肿胀幅度均显著低于对照组（p < 0.01），且恢复动力学发生改变——处理组细胞更早、更快地恢复至初始体积。OIT组和MIX组趋势相似，均表现为肿胀减弱和快速回落；DCOIT组细胞在恢复期体积略高于其他处理组，但仍低于对照组。至记录结束时，所有处理组均恢复至基线水平，表明暴露影响了细胞体积调节的幅度和时效动力学，但并未完全损害RVD过程，可能与离子通道活性、膜通透性改变有关。
**3.4 吞噬活性**
吞噬活性分析显示，OIT、DCOIT及其混合物暴露后，吞噬性血细胞百分比均较对照组显著降低。其中，MIX组的吞噬活性最低，表明联合暴露对血细胞功能活性的损害最为严重，提示异噻唑啉酮类化合物可导致免疫细胞功能性损伤，且联合暴露可能加剧免疫功能的抑制。
**3.5 消化腺、鳃和血淋巴中的基因表达调控**
在消化腺中，MnSOD在所有处理组中均明显上调，OIT组达2.98倍、DCOIT组2.25倍、MIX组3.33倍；Cu/ZnSOD分别上调2.17倍、1.30倍和2.59倍；CYP4Y1呈现最强的转录调控，分别达3.38倍、2.50倍和4.13倍；TNF-α分别上调3.11倍、2.10倍和3.50倍；IL-17分别上调1.98倍、1.30倍和2.00倍。MIX组的表达水平在大多数基因上均为最高。在鳃组织中，MnSOD分别上调2.18倍（OIT）、1.79倍（DCOIT）和3.05倍（MIX）；Cu/ZnSOD分别为1.76倍、1.12倍和2.10倍；CYP4Y1为3.05倍、1.54倍和3.23倍；TNF-α为2.69倍、1.98倍和2.90倍；IL-17为1.13倍、1.15倍和1.80倍。在血淋巴中，MnSOD分别上调2.40倍（OIT）、1.55倍（DCOIT）和2.80倍（MIX）；Cu/ZnSOD为2.00倍、1.09倍和2.20倍；CYP4Y1为2.56倍、1.12倍和3.44倍；TNF-α为2.58倍、2.20倍和2.72倍；IL-17为2.00倍、1.80倍和2.60倍。总体而言，所有组织均呈现抗氧化、解毒和炎症基因的协同上调，且MIX组一般表现出最高的诱导水平，反映出系统性的应激反应。
**四、讨论与结论**
讨论部分指出，研究揭示了亚致死浓度OIT、DCOIT及其混合物对地中海贻贝多个生理层面的功能性影响。血细胞活力总体保持较高，但OIT引起的膜完整性和溶酶体稳定性下降表明其在环境相关浓度下即可引发初始细胞应激。消化腺细胞表现出更强的耐受性，这可能与解毒和抗氧化防御机制的适应性激活有关。RVD实验显示的细胞体积调节动力学改变提示污染物干扰了离子转运和膜通透性。吞噬活性的显著降低表明免疫功能受到损害，MIX组最为严重。转录水平上抗氧化基因（MnSOD、Cu/ZnSOD）、外源物代谢基因（CYP4Y1）和炎症因子（TNF-α、IL-17）在各组织中的协同上调反映了活性氧（ROS）生成增多、解毒需求增加和免疫信号激活的整合反应。MIX组在各指标中普遍表现出最强响应，提示联合暴露可能比单一化合物引发更强烈的生物学效应，但这应被理解为联合暴露下更强的响应而非协同或非加性相互作用的证据。研究同时承认，由于未对暴露介质中的实际浓度进行化学分析验证，所报告的暴露水平应视为名义浓度；14天的暴露期相对较短，可能不足以完全反映长期环境暴露的效应，未来需开展更长时间的慢性暴露研究。
结论部分翻译：本研究揭示了OIT和DCOIT对地中海贻贝（*Mytilus galloprovincialis*）的生态生理影响，证明暴露于这些杀生剂（包括联合暴露条件）可改变细胞功能和免疫相关反应。尽管总体细胞活力保持相对较高，但暴露影响了溶酶体稳定性、吞噬活性和渗透调节动力学，表明细胞稳态受到干扰。在分子水平上，参与氧化应激（MnSOD、Cu/ZnSOD）、外源物代谢（CYP4Y1）和炎症信号传导（TNF-α、IL-17）的基因表达上调，揭示了解毒和免疫通路的激活。最后，这些发现强调了在测试的名义浓度下同时暴露于多种杀生剂可能带来的潜在风险，并为未来深入研究异噻唑啉酮类化合物对海洋生物和生态系统健康的影响提供了基础。
