丙泊酚通过调控NEDD4L介导的HTR2B泛素化减轻OGD/R诱导的脑缺血再灌注损伤相关神经元损伤

《Biochemical and Biophysical Research Communications》：Propofol alleviates OGD/R-induced cerebral ischemia–reperfusion injury-related neuronal injury by regulating NEDD4L-mediated ubiquitination of HTR2B

　　

## 摘要

**背景** 脑缺血-再灌注损伤（CIRI）是缺血性脑损伤中的重要病理过程。先前的研究表明，丙泊酚可减轻CIRI相关的神经元损伤；然而，其潜在的分子机制尚未完全阐明。

**方法** 通过使SK-N-SH细胞暴露于氧糖剥夺/复氧（OGD/R）建立体外CIRI相关损伤模型，随后用不同浓度的丙泊酚进行处理。分别采用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法、末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记（TUNEL）法、酶联免疫吸附测定（ELISA）、特定检测试剂盒和JC-1染色检测细胞活力、凋亡、炎症细胞因子水平、氧化应激及线粒体膜电位（MMP）。使用SwissTargetPrediction数据库预测丙泊酚的潜在靶点。通过逆转录定量聚合酶链反应（RT-qPCR）和Western blot检测相关基因的mRNA和蛋白表达水平。使用UbiBrowser预测与5-羟色胺受体2B（HTR2B）相关的泛素连接酶。进行泛素化实验、MG132处理和环己酰亚胺（CHX）追踪实验，以验证神经前体细胞发育性下调4样蛋白（NEDD4L）对HTR2B泛素化和蛋白稳定性的调控作用。最后建立大脑中动脉闭塞（MCAO）模型进行体内验证。

**结果** 丙泊酚显著减轻了OGD/R诱导的SK-N-SH细胞损伤、炎症反应、氧化应激和线粒体功能障碍（P < 0.05）。HTR2B敲低可减弱这些OGD/R诱导的损伤表型（P < 0.05）。HTR2B过表达削弱了丙泊酚对OGD/R诱导的SK-N-SH细胞损伤的保护作用（P < 0.05）。NEDD4L促进HTR2B的K48连接泛素化并降低HTR2B蛋白稳定性（P < 0.05）。HTR2B过表达逆转了NEDD4L过表达在OGD/R处理的SK-N-SH细胞中介导的保护作用（P < 0.05）。NEDD4L敲低加剧了OGD/R诱导的细胞损伤并削弱了丙泊酚介导的保护作用，而NEDD4L过表达则进一步增强了丙泊酚的保护效果（P < 0.05）。在体内实验中，丙泊酚减小了MCAO小鼠的梗死体积，改善了神经功能缺陷，减轻了脑组织病理损伤，并调控了NEDD4L/HTR2B轴和炎症细胞因子水平（P < 0.05）。

**结论** 丙泊酚至少部分通过促进NEDD4L介导的HTR2B泛素化来减轻CIRI相关的神经元损伤，为其神经保护作用提供了新的实验证据。

## 引言

缺血性卒中（IS）是全球范围内导致死亡和慢性残疾的主要神经系统疾病之一，通常与脑动脉闭塞或狭窄引起的局部脑血流中断有关[1, 2, 3]。及时恢复缺血区域的血流是挽救受损脑组织的重要治疗策略。然而，恢复血流可能引发脑缺血-再灌注损伤（CIRI），这可能进一步加重神经功能缺损并损害患者预后[4, 5, 6]。CIRI的发病机制涉及多种病理过程[7, 8]。因此，阐明CIRI过程中神经元损伤的分子机制并识别有效的干预措施对于改善脑缺血后的神经功能恢复具有重要意义。

作为一种突出的静脉麻醉镇静药物，丙泊酚在临床麻醉和重症监护镇静中常规使用。除其镇静和麻醉作用外，其在神经系统损伤中的多种保护作用引起了越来越多的关注[9, 10, 11]。近年来，越来越多的证据表明丙泊酚在CIRI中具有神经保护作用，主要涉及抗炎和抗氧化效应、调节凋亡以及维持线粒体功能。例如，据报道丙泊酚通过下调程序性死亡配体1（PD-L1）表达和减少自噬活性来减轻CIRI[12]，并通过核因子红系衍生2相关因子2（Nrf2）/谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）信号通路抑制铁死亡性细胞死亡[13]。最近，巨噬细胞膜包被的生物仿制丙泊酚脂质体被证明可增强丙泊酚在缺血脑损伤灶的蓄积，并通过激活EGFR/Nrf2信号、抑制铁死亡和恢复线粒体稳态来减轻缺血性卒中[14]。然而，丙泊酚的神经学效应可能因暴露阶段和病理背景的不同而有所变化。据报道，发育期丙泊酚暴露会损害秀丽隐杆线虫的学习和记忆功能，伴随rgs-3上调和EGL-4核转位受损，抑制rgs-3可部分缓解这些异常[15]。类似地，最近有研究表明幼年期七氟醚暴露会通过内质网应激诱导持续的学习和记忆障碍[16]。综合这些发现表明，麻醉药物的神经学效应具有背景依赖性，这凸显了阐明丙泊酚介导的CIRI保护作用的特定分子机制的重要性。然而，丙泊酚介导的神经保护作用背后的关键下游分子靶标和具体调控机制仍未完全阐明。

5-羟色胺介导的信号转导由5-羟色胺受体2B（HTR2B）积极调控，HTR2B属于5-HT家族G蛋白偶联受体分类。作为重要的神经递质，5-羟色胺有助于调控中枢神经系统中广泛的生理和行为功能[17, 18]。除其生理作用外，HTR2B还与多种人类疾病的发病机制相关，其在心血管疾病、精神障碍和癌症中的功能已被广泛研究[17, 19, 20]。近期证据表明HTR2B与CIRI相关的神经炎症密切相关，抑制HTR2B可减轻CIRI期间的微胶质细胞M1极化和神经炎症反应[21]。然而，丙泊酚是否通过调控HTR2B发挥CIRI保护作用仍有待进一步验证。

泛素化是一种高度保守的翻译后事件，负责调控蛋白质稳态、促进代谢周转和引导细胞内信号通路[22, 23]。E3泛素连接酶识别特定的底物蛋白并促进其泛素化，从而参与调控细胞应激、炎症反应和神经元损伤[24]。作为一种HECT结构域E3泛素连接酶，神经前体细胞发育性下调4样蛋白（NEDD4L）调控特定靶蛋白的泛素化，从而驱动多种病理过程[25, 26]。先前的研究表明，NEDD4L相关的泛素化调控参与脑损伤和脑缺血相关病理过程。例如，NEDD4L/酰基辅酶A合成酶长链家族成员4（ACSL4）轴已被发现与神经元铁死亡有关[27]，甲基转移酶3（METTL3）据报道通过稳定NEDD4L mRNA来调控转铁蛋白受体（TFRC）泛素化和卒中相关铁死亡[28]。然而，NEDD4L是否介导HTR2B的泛素化以及该过程是否贡献于丙泊酚对CIRI相关神经元损伤的保护作用仍有待阐明。

本研究利用氧糖剥夺/复氧（OGD/R）处理的SK-N-SH细胞和大脑中动脉闭塞（MCAO）小鼠模型，探讨丙泊酚在CIRI中的神经保护作用及相关分子机制。本研究旨在阐明丙泊酚是否通过调控NEDD4L介导的HTR2B泛素化来减轻OGD/R诱导的细胞损伤、炎症反应、氧化应激和线粒体功能障碍。这些发现旨在为阐明丙泊酚的神经保护机制提供新的实验证据，并为CIRI干预识别潜在的分子靶标。

## 材料与方法

### 细胞培养与OGD/R处理

人神经母细胞瘤细胞系SK-N-SH购自Procell（中国武汉）。细胞在含10%胎牛血清（FBS，Gibco，美国纽约州大岛）和1%青霉素-链霉素（Gibco）的Dulbecco改良鹰氏培养基（DMEM，Procell）中培养。培养条件为37°C、5% CO?环境。短串联重复序列（STR）鉴定确认了细胞系纯度，常规筛查确保样本无污染。

### 丙泊酚减轻OGD/R诱导的SK-N-SH细胞损伤、炎症反应、氧化应激和线粒体功能障碍

为探讨丙泊酚对OGD/R诱导的神经元损伤的影响，将SK-N-SH细胞暴露于OGD/R并用不同浓度的丙泊酚（15 μM、30 μM和45 μM）处理。CCK-8检测显示，OGD/R显著降低了SK-N-SH细胞活力，而15 μM、30 μM和45 μM丙泊酚处理以浓度依赖方式恢复了细胞活力，其中45 μM显示出最显著的保护效果，因此被选用于后续实验（图1A）。

## 讨论

CIRI后的神经功能障碍源于多种病理事件的共同作用，如氧化应激和线粒体功能障碍，而非单一机制所致[30, 31, 32]。因此，识别能够调控多种损伤相关过程的保护策略对于改善CIRI相关神经元损伤具有重要意义。丙泊酚是一种常用的静脉麻醉药物，多项研究报告其在CIRI中发挥神经保护作用。

## CRediT作者贡献声明

Wei Zhang：撰写——初稿，监督，资源，项目管理。Defa Wang：可视化，调查，资金支持获取，概念化。Huili Zheng：验证，软件。Quanyang Lin：方法论，数据整理。Baoxin Ma：形式分析。

## 伦理声明

本研究遵循ARRIVE（动物研究：体内实验报告）指南进行。本研究经厦门大学附属中山医院批准（批准号：xmzsyyky2024-533）。

## 数据可用性声明

数据可向通讯作者合理请求获取。

## 利益冲突

作者无利益冲突需要声明。

## 伦理批准与参与同意

实验操作符合实验室动物护理和使用指南，并获厦门大学附属中山医院动物伦理委员会批准（批准号：xmzsyyky2024-533）。动物实验严格遵循ARRIVE指南和3Rs原则（替代、减少、优化）。

## 资金

无资金支持可报告。

## 竞争利益声明

? 作者声明不存在已知的竞争性经济利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

## 致谢

无。

Wei Zhang | Baoxin Ma | Quanyang Lin | Huili Zheng | Defa Wang

厦门大学附属中山医院麻醉科，中国厦门 361004