LRLLR 膜转位基序的序列依赖性转移性：SmacN 和 NR2B9c 肽的计算研究

《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes》：Sequence-dependent transferability of the LRLLR membrane translocation motif: A computational study of smacN and NR2B9c peptides

　　

- C端添加LRLLR将一个+72 kJ/mol的smacN能垒转变为?50 kJ/mol的膜内势阱。
- 在NR2B9c的N端添加LRLLR使其跨膜能垒升高14 kJ/mol。
- LRLLR的可转移性取决于电荷间距、极性残基的水化作用以及构象柔性。
- 路径依赖的伞形采样揭示了LRLLR的PMF（平均力势）中存在进/出的不对称性。
- 计算筛选可在实验验证之前优先筛选CPP（细胞穿透肽）偶联物。

引言

细胞膜的磷脂双层对极性药物候选分子构成了一道难以逾越的屏障，有效地排除了那些缺乏被动扩散所需的疏水性或特异性转运机制的肽类药物和大分子[1]、[2]、[3]。因此，许多有前景的治疗性肽、蛋白质和核酸偶联物由于无法达到足以发挥治疗效力的胞内浓度而未能进入临床应用[4]、[5]、[6]、[7]。在这些分子中，细胞穿透肽（CPPs）作为一种有前景的分子载体脱颖而出。这些短序列通常由5–30个氨基酸组成，具有独特的穿越质膜并在携带过程中运输包括蛋白质、核酸和小分子在内的多种货物的能力[8]、[9]。1988年首次发现HIV-1 TAT蛋白能够跨膜转位[10]，随后对由Antennapedia同源域衍生而来的Penetratin进行了表征[11]、[12]，CPPs由此确立了一种胞内递送的新范式。最初认为它们通过内吞作用进入细胞，但后续的方法学进展表明，这些肽在机制性质上相当复杂，通常具有不止一种转位机制[13]，而它们所采用的机制在很大程度上是多因素决定的[14]、[15]、[16]。

尽管具有转位能力，CPPs仍存在显著的局限性，阻碍了其临床转化[17]、[18]、[19]。其递送效率高度依赖于所携带的货物，大分子蛋白质和核酸常常被困在内体区室中，而无法到达胞质[20]。此外，细胞摄取机制仍然不可预测，会随浓度、膜组成和序列背景的变化而变化，而这些变化的方式尚未被完全理解。这些限制凸显了识别那些决定膜转位的特定序列基序、并确定这些元件是否可以被合理地转移以赋予治疗性肽细胞穿透能力的迫切需求。

鉴定负责膜转位的特定序列基序一直颇具挑战性，因为CPP活性往往源于电荷分布、疏水性和二级结构倾向之间复杂的相互作用。然而，近期的系统性筛选方法已经开始分离出最小的穿透元件[21]、[22]、[23]。Marks及其同事开发了一种方法，通过在无蛋白的膜模拟物上筛选随机生成的肽库，来鉴定自发转位的CPP[24]，从而确保阳性结果必须在没有主动生物学过程介导的情况下穿越双层膜。该方法产生了一组自发转位的CPP，其中TP1和TP2肽表现出卓越的穿透能力。值得注意的是，对成功序列的分析揭示了一个反复出现的基序：五肽LRLLR频繁出现在能够穿越膜而不破坏双层完整性的肽中。

随后的生物物理表征揭示了LRLLR介导转位的机制细节。当TP1和TP2与外侧叶片上带有荧光团NBD的囊泡共孵育时，荧光脂质重新分布到内侧叶片，表明肽转位涉及一种耦合的脂质翻转机制[25]。这些发现通过核磁共振波谱与分子动力学模拟的结合得到了证实和拓展[26]。这一综合方法表明，TP1在嵌入膜时占据了一个显著的势能阱，并且关键在于，精氨酸残基的两个胍基之间的间距对于穿透活性至关重要。作者提出，每个胍基同时与双层的相对两个叶片相互作用，形成一种张力配置，作为促进脂质翻转及随之而来的转位的过渡态。夹在两个精氨酸之间的疏水性亮氨酸残基被认为能够稳定这种过渡态，通过减少带电基团暴露于疏水核心而加速转位。

尽管大量证据表明LRLLR序列负责TP1和TP2的穿透活性[22]、[27]，但这一能力是否可以转移到其他肽上仍未得到确认。本研究通过将LRLLR基序附加到两个具有临床前景的肽——smacN和NR2B9c——上来回答这一问题。选择这些候选分子不仅因为它们具有临床相关性，还因为其靶标识别位点允许在相反的两端进行修改，从而使我们能够在C端和N端两个位置测试基序转移。

smacN肽由Smac/DIABLO蛋白的四个N端残基（AVPI）组成，这是一种通过中和凋亡抑制蛋白（IAPs）来促进细胞凋亡的线粒体因子[28]。这一最小的四肽保留了结合并抑制XIAP和survivin的能力[29]、[30]。Survivin过表达出现在多种致癌肿瘤中，其升高浓度与对化疗的耐药性相关[31]、[32]、[33]。因此，只要smacN能够足够的胞内浓度，它就代表了一种针对survivin阳性肿瘤的治疗药物的有前景的候选物[34]。由于smacN是通过其N端在IAP结合沟中被识别的[35]，因此修改必须引入到C端，这使得该肽成为测试C端添加LRLLR是否能赋予膜穿透活性的理想候选物。

NR2B9c肽由NMDA受体NR2B亚基的九个C端残基（KLSSIESDV）组成。在兴奋毒性条件下，通过NMDA受体的过量谷氨酸信号传导触发了一连串病理级联反应：支架蛋白PSD-95将活化的NR2B亚基与神经元一氧化氮合酶（nNOS）偶联，导致有毒的一氧化氮产生及随后的缺血性损伤[36]、[37]、[38]。NR2B9c以竞争性方式破坏PSD-95/NR2B相互作用，从而在不影响正常NMDA受体功能的前提下中断这一神经毒性信号通路[39]、[40]。由于靶标识别是通过C端的PDZ结合基序发生的，因此修改必须引入到N端，这使得NR2B9c适合测试N端添加LRLLR。

NR2B9c的治疗潜力已通过其与TAT细胞穿透肽的偶联在临床上得到评估。所得到的构象NA-1（亦称nerinetide）曾进入针对急性缺血性卒中治疗的III期临床试验[41]、[42]。不幸的是，ESCAPE-NA1试验未能证明NA-1相比安慰剂能减少梗死体积，并有证据表明阿替普酶（一种在试验中给予所有患者的溶栓药物）抑制了被测药物的效果。随后的一项试验ESCAPE-NEXT正在研究单独接受血管内取栓术的患者中使用NA-1的情况[43]。这些临床结果确立了NR2B9c有效性的概念验证，但也凸显了对优化递送策略的持续需求。更短的LRLLR基序能否提供足够的膜转位增强——与更长的TAT序列相比，可能伴随更低的免疫原性和改善的药代动力学——仍是一个开放性问题。

为评估LRLLR基序的转位增强潜力，我们采用了伞形采样分子动力学模拟来计算肽跨越模型磷脂双层转位的平均力势（PMF）。这一计算方法应用一系列谐波约束将肽定位在距双层中心特定距离的位置，在每个位置采样构象空间后，使用加权直方图分析（WHAM）方法重构完整的自由能轮廓。伞形采样已被广泛用于膜转位研究，成功再现了氨基酸侧链类似物[44]、抗菌肽[45]以及包括寡聚精氨酸和penetratin在内的细胞穿透肽[46]的实验转位速率和分配系数。

该方法学为本研究提供了若干优势。首先，PMF计算提供了定量化的能量信息——能垒高度和势阱深度——这些信息可以直接与转位可行性及膜分配相关联。其次，分子动力学模拟的原子级细节揭示了能量轮廓背后的结构机制，包括氢键模式、二级结构变化以及难以在实验上获取的膜扰动。第三，计算筛选使得在相同条件下直接比较修饰与未修饰的肽成为可能，从而在不引入不同实验制备或测量技术所带来的混杂变量的情况下，分离出LRLLR基序的贡献。

本研究旨在确定LRLLR基序是否作为一个可转移的转位模块，能够将膜穿透活性赋予治疗性肽。我们的工作假设是，添加LRLLR可以促进膜转位，同时保留治疗靶标识别所需结构特征。为评估这一假设，我们考察了三个具体问题：第一，添加LRLLR是否能降低smacN和NR2B9c膜转位的自由能能垒；第二，基序添加是否保留了这些治疗性肽靶标识别所需的结构特征；第三，由PMF轮廓和结构分析所揭示的何种分子机制解释了LRLLR促进转位的能力或缺乏能力。研究结果提供了关于CPP活性序列决定因素的深刻洞见，并为理性设计具有细胞穿透性的治疗性肽偶联物提供了实用指导。

方法

为评估LRLLR基序的转位增强潜力，我们采用了将引导分子动力学与伞形采样相结合的 computational workflow，以计算肽跨越模型磷脂双层转位的平均力势轮廓。该工作流程分为三个阶段：首先，分别制备和平衡肽与膜体系，以获得稳定的初始构象；其次，通过引导分子动力学模拟生成……

结果

为考察LRLLR基序的膜转位性质是否可转移至治疗性肽，我们对三个体系进行了伞形采样分子动力学模拟：单独的LRLLR基序、带有及不带C端LRLLR添加的smacN肽（AVPI）、以及带有及不带N端LRLLR添加的NR2B9c肽（KLSSIESDV）。对每个体系，我们计算了跨越POPC/POPG（90:10）双层的平均力势（PMF）轮廓，并分析了……

讨论

我们的模拟表明，先前被鉴定为TP1细胞穿透肽被动转位所必需的LRLLR基序，可以在特定结构和理化条件下将膜转位性质赋予其他肽。将LRLLR附加到smacN的C端彻底消除了转位能垒，取而代之的是在外侧叶片内形成了一个有利的?50 kJ/mol势阱。相比之下，在NR2B9c的N端添加LRLLR……

结论

本研究确立了细胞穿透基序的转移是可行的，但依赖于序列。LRLLR基序本身表现出有限的自发转位能力；尽管表现出很强的界面亲和力（?29 kJ/mol），但该五肽单独存在时面临一个相当大的能垒（自界面极小值算起为+78 kJ/mol），这一能垒可能需要额外的因素——如膜电位、货物相互作用或巨极化事件——才能实现自发穿越。

相比之下……

CRediT作者贡献声明

D. Mu?oz-Gacitúa：撰写–初稿，验证，软件，方法论，研究，形式分析，数据整理，概念构思。Jenny Blamey：撰写–审稿与编辑，监督，项目管理，资金获取。

生成式AI及AI辅助技术在写作过程中使用的声明

在准备本手稿期间，作者利用了一个本地自托管的大语言模型（LLM）来提升语法、句子结构和可读性。为确保数据治理并维护未发表研究的机密性，所有AI辅助工作均使用Biociencia的自托管LLM基础设施完成，防止任何外部数据传输。所有科学内容、方法论、数据分析、解释和结论仍是原创的智力工作。

利益冲突声明

作者声明不存在利益冲突。本研究由Biociencia基金会和智利圣地亚哥大学（USACH）全额资助。资助方在设计研究；收集、分析或解释数据；撰写手稿；或决定发表结果的方面均不承担角色。

致谢

D. Mu?oz-Gacitúa感谢智利圣地亚哥大学（USACH）研究、创新与创作副校长办公室授予的博士后奖学金（POSTDOC_DICYT 022443BA）的支持。作者感谢并致谢Biociencia基金会提供了使本研究成为可能的计算资源。

D. Mu?oz-Gacitúa|Jenny Blamey