《Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Molecular Cell Research》：SHH mediated human dopaminergic neuron differentiation is facilitated by transcription factor ZIC3
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摘要不同神经元亚型的特异性分化涉及复杂的转录因子网络。我们实验室此前的研究表明，小脑锌指转录因子（ZIC）3通过不同的机制调控小鼠嗅球（OB）和中脑（MB）神经元中酪氨酸羟化酶（TH）的表达，后者是多巴胺能（DA）神经元的标志物。由于小鼠TH启动子近端区域不存在ZIC3共识结
摘要
不同神经元亚型的特异性分化涉及复杂的转录因子网络。我们实验室此前的研究表明，小脑锌指转录因子（ZIC）3通过不同的机制调控小鼠嗅球（OB）和中脑（MB）神经元中酪氨酸羟化酶（TH）的表达，后者是多巴胺能（DA）神经元的标志物。由于小鼠TH启动子近端区域不存在ZIC3共识结合位点，ZIC3在嗅球中通过与ER81相互作用来调控TH表达；而中脑中因缺乏ER81，ZIC3则通过增强PITX3的表达来调控TH。为分析这一观察结果是否在人类中进化保守，本研究采用不同的人类干细胞模型体系，以探讨ZIC3在人类多巴胺生成中的作用。牙齿髓干细胞（DPSCs）在适当诱导信号作用下分化后表达TH。功能获得与功能缺失实验证明ZIC3对TH表达至关重要。ZIC3通过结合TH启动子区域内的响应元件，激活TH基因的转录。添加SHH——一种已知的促进多巴胺能分化的形态发生素——可增加TH的表达，然而，在ZIC3缺失时，这种调控作用受到抑制。机制研究揭示，SHH通过GLI蛋白结合ZIC3启动子来影响ZIC3的表达。在分化为类多巴胺神经元的hiPSCs中，也观察到ZIC3在TH表达中具有类似作用。总之，本研究首次证明了ZIC3在人类来源细胞中SHH介导的TH特异性分化中的重要作用。
引言
不同的转录调控代码支配着多巴胺能（DA）神经元的发育。这些代码在很大程度上具有物种特异性，同时也具有空间特征[1]。多巴胺能神经元的发育是一个极其复杂的过程，因为存在多组DA神经元，每组具有独特的发育轨迹、中枢神经系统中的位置和功能。所有这些DA神经元群体的共同特征是合成多巴胺，该过程由限速酶酪氨酸羟化酶（TH）调控[2]。鉴于这些DA神经元广泛的存在和功能，它们成为高度关注的研究课题。大量研究精力聚焦于中脑和嗅球DA神经元，因其在帕金森病相关研究中具有重要的临床意义[3]、[4]。
已有多篇转录因子（TFs）被证实调控DA神经元的特异性分化。参与DA发育的主要转录因子包括：LMX1a——在产生DA神经元的前体细胞中表达[5]；ENGRAILED 1/2——调控这些神经元的模式形成和区域化[6]；PITX3——是关键的谱系决定因子，与FOXA2和NURR1一起，对多巴胺合成及这些神经元的成熟和存活至关重要[7]、[8]、[9]。许多DA决定转录因子参与调控TH，例如，NURR1和LMX1a均直接结合TH启动子并正向调控其表达[10]。
bHLH锌指转录因子——ZIC3是一种已知调控多能性和神经发生的转录因子[11]、[12]。ZIC家族由5个成员组成，其中ZIC3因其早期发育表达、基因位于X染色体（小鼠和人类均有）以及参与多种发育事件（从原肠形成、神经管闭合、体轴建立、多能性调控、心脏发育到神经元命运决定）而成为研究热点[13]、[14]、[15]、[16]。Zic3 是神经诱导期间由成纤维细胞生长因子（FGF）信号诱导的即时早期基因[17]。Zic3过表达增强了下游bHLH型神经转录因子Ascl3、Neurogenin1和Neurod1的激活，从而导致神经外胚层扩张[18]。在非洲爪蟾胚胎早期发育中Zic3的错误表达导致神经板变宽[19]。爪蟾中Zic3的表达受多种关键发育蛋白调控，如Activin和Nodal信号[20]。抑制BMP信号——神经命运决定的关键组分——会导致ZIC3表达增强[21]。除Nodal和Wnt通路基因外，近期在非洲爪蟾中的基因组学研究显示，Zic3调控多个参与早期神经外胚层特异性分化的基因[22]。
Zic3在维持人类和小鼠胚胎干细胞多能性方面发挥重要作用[23]、[24]。基序富集分析显示ZIC3是ESC从初始态向许可态转变的潜在调控因子[25]。尽管小鼠和人类ZIC3蛋白之间具有超过99%的同源性，但其在不同物种中的功能存在差异。例如，ZIC3与其他多能性因子OCT4、SOX2和KLF4一起在小鼠成纤维细胞中诱导重编程，但相同的转录因子组合在人类成纤维细胞中则促进向稳定的类神经前体细胞的转分化[26]、[27]。我们近期的研究表明，ZIC3能够通过两种不同的分子机制双态调控嗅球和中脑中TH的表达[28]。这激发了我们探究ZIC3在人类DA神经元分化过程中调控TH的作用是否进化保守。
本研究利用人类干细胞模型体系——人类诱导多能干细胞（hiPSCs）和牙齿髓干细胞（DPSCs），确立了ZIC3可通过直接结合人类TH启动子正调控其表达，这与小鼠中TH的调控方式不同。此外，通过功能获得与功能缺失实验，我们发现ZIC3是SHH信号通路中调控TH表达的关键组分，我们将TH表达作为分化细胞类多巴胺身份的替代标志物。我们的研究为DA神经元调控因子谱系增添了ZIC3，由于这些神经元具有重要的临床意义，该领域的任何增量性知识都弥足珍贵。
章节摘要
DPSC培养与分化
牙齿髓干细胞（DPSCs）购自CellSpace Technologies公司，用于实验研究。DPSCs在含有10% FBS、2 mM Glutamax、1%青霉素和1×链霉素的DMEM-Knockout（DMEM-KO）培养基中培养（所有试剂购自Life Technologies），每48小时更换培养基，当细胞汇合度达80-90%时进行传代。实验中使用第5-7代的细胞。
对于成骨分化，DPSCs在成骨分化培养基中培养
ZIC3表达在DPSC向神经元分化过程中被诱导
来源于牙髓血管周围微环境的DPSCs被认为源自迁移的神经嵴细胞，这些细胞同时表达中胚层和神经外胚层干细胞的早期标志物[31]。体外和体内研究均表明，与其他组织来源的间充质干细胞相比，DPSCs具有更强的神经元分化倾向。与其他间充质干细胞类似，hDPSCs可分化为经典的三个中胚层谱系（数据未示），并显示特异的间充质干细胞表面标志物
讨论
多巴胺能神经元是一组儿茶酚胺能神经元，分布于大脑不同区域。TH是多巴胺合成途径中的限速酶，受不同转录因子如PITX3、LMX1A、NURR1和ENGRAILED的精密调控[1]、[10]。然而，TF介导的TH调控因物种差异而较为复杂。例如，上述转录因子在啮齿动物和
结论
调控神经元身份的转录因子网络复杂且常具有物种特异性。尽管ZIC3调控TH的作用在小鼠和人类中是进化保守的，但机制完全不同。在小鼠中，由于缺乏直接结合TH的位点，ZIC3通过与其它转录因子协同作用来补偿；而在人类中，ZIC3可独立结合人类TH启动子并驱动其表达。这一信息对于推进我们理解转录因子作用方式的知识可能具有重要价值
CRediT作者贡献声明
Preethi Sheshadri：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，验证，方法学，调查研究，形式化分析。Smitha Bhaskar：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，验证，方法学，调查研究，形式化分析。Jeevan Gowda：撰写——审阅与编辑，验证，方法学。Shreetama Banerjee：撰写——审阅与编辑，方法学。Michael R. Duchen：撰写——审阅与编辑，指导。Jyothi Prasanna：撰写——审阅与编辑，
资金
本研究由DBT资助的项目BT/PR44638/MED/31/453/2021支持，项目获得者为Anujith Kumar。我们感谢DST WISE KIRAN奖学金为Shreetama Banerjee提供资助[DST/WISE-PhD/LS/2023/13 (G)]，以及Manipal高等教育学院的内部资助。
致谢
我们感谢Anujith Kumar实验室成员在研究和论文撰写过程中提供的协助。感谢Manipal高等教育学院（MAHE），印度Manipal，提供内部资助并支持本研究工作的开展。
Preethi Sheshadri | Smitha Bhaskar | Jeevan Gowda | Shreetama Banerjee | Michael R. Duchen | Jyothi Prasanna | Anujith Kumar
Manipal再生医学研究所，Manipal高等教育学院，印度Karnataka, 576104
