《Cogent Food & Agriculture》：Appraising the potential of gene editing in Zimbabwe’s crop improvement programmes: a review
编辑推荐：
摘要
津巴布韦和撒哈拉以南非洲地区面临紧迫的压力，需要养活预计到2050年将翻倍的快速增长的人口，同时应对气候变率。农业部门占津巴布韦国内生产总值（GDP）的15%–18%，占出口收入的40%以上。由于津巴布韦70%–80%的人口依赖雨养农业，传统育种方法被
摘要
津巴布韦和撒哈拉以南非洲地区面临紧迫的压力，需要养活预计到2050年将翻倍的快速增长的人口，同时应对气候变率。农业部门占津巴布韦国内生产总值（GDP）的15%–18%，占出口收入的40%以上。由于津巴布韦70%–80%的人口依赖雨养农业，传统育种方法被认为过于缓慢。基因组编辑提供了一种更快、更精确的替代方案。本文综述了基因编辑如何增强粮食安全和农民的适应性，并与国家经济目标保持一致。所讨论的关键编辑技术包括CRISPR-Cas9和转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs），它们能够在无需引入外源DNA的情况下实现靶向遗传改变。玉米改良的机会包括耐热性和抗旱性、营养强化以及抗病虫害。在小麦方面，包括锈病抗性、非生物胁迫和籽粒品质。在高粱方面，优先事项包括独脚金（striga）和饲草品质。在马铃薯方面，编辑可解决晚疫病耐受性和块茎品质问题。这些创新的商业化涉及多种策略；我们建议利用公私合作伙伴关系来共享知识产权并降低费用。津巴布韦优先进行能力建设，并制定明确的法规以区分基因编辑产品与转基因生物（GMOs）。这种方法将使该国能够利用基因组编辑生产具有韧性、高产的主粮作物。
3. 结果与讨论
3.1. 基因编辑技术
3.1.1. 农杆菌介导的基因转化
农杆菌介导的基因转移是一种将外源基因导入植物细胞以产生转基因植物的技术。该技术利用农杆菌（一种土壤细菌）将Ti质粒的一部分（称为T-DNA）转移至植物细胞的内在能力。转移的DNA随后可整合到植物基因组中，产生持久的遗传改变。
3.1.2. 锌指核酸酶（ZFNs）
锌指核酸酶（ZFNs）是工程化蛋白质，将锌指DNA结合域与核酸酶结构域结合。锌指结构域经工程改造以识别并附着于特定DNA序列，使核酸酶结构域能够诱导DNA双链断裂。ZFNs已用于多种烟草和玉米品种的靶向基因编辑。ZFNs的缺点包括脱靶效应和效率低下。
3.1.3. 转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）
21世纪见证了更先进和精确的创新，包括TALENs的发展。TALENs产生靶向DNA双链断裂。它们包含一个来源于转录激活因子样效应物（TALEs）的可修饰DNA附着结构域，连接至核酸酶结构域。DNA结合结构域识别并附着于特定DNA序列，使核酸酶结构域能够切割DNA。TALENs是可编程的，并已用于创制抗病水稻和耐除草剂大豆。
3.1.4. 成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）
21世纪引入了成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）方法。CRISPR-Cas系统分为两类（1类和2类），再细分为六种类型（I至VI型）。1类（I、III和IV型）系统在其CRISPR核糖核蛋白效应核酸酶中使用多种Cas蛋白；2类（II、V和VI型）系统使用单一Cas蛋白。1类CRISPR-Cas系统最常在细菌和古菌中发现，约占所有已鉴定CRISPR-Cas位点的90%。2类CRISPR-Cas系统（约占剩余10%）几乎仅存在于细菌中，并组装成由CRISPR RNA（crRNA）和Cas蛋白组成的核糖核蛋白复合物。最广泛表征的CRISPR-Cas系统是化脓性链球菌（Streptococcus pyogenes, Sp）中的II型亚型II-A，其使用蛋白SpCas9，而Cas9是第一个被工程改造用于基因编辑的Cas蛋白。
a) CRISPR-Cas9
CRISPR-Cas9是一种强大的基因编辑工具，使科学家能够精确切割和改变DNA序列，从而在生物体基因组中删除、添加或改变基因。该过程包含两个主要元件：Cas9蛋白和引导RNA。Cas9蛋白充当分子剪刀，而引导RNA充当向导，共同靶向并修饰特定DNA区域。CRISPR-Cas9已用于同时编辑小麦、水稻和番茄等农业主粮作物中的多个基因（多重编辑）。
b) CRISPR-Cas12a
II类V型CRISPR-Cas12a是一种新的RNA引导的核酸内切酶，最近被用作替代性基因组编辑工具，在基因组编辑应用领域正成为一种强大的分子剪刀。CRISPR-Cas12在体内靶基因编辑方面具有优于Cas9的特性。与Cas9不同，它识别富含T的原间隔区邻近基序（PAM）序列，产生交错的双链DNA切割，并表现出独特的“反式切割”活性，即在结合其靶标后可无差别地切割附近的单链DNA，使其成为高灵敏度检测的理想选择。
3.1.5. 碱基编辑
碱基编辑是一种基因组编辑技术，可在基因组DNA或细胞RNA中精确产生点突变，而无需产生双链DNA断裂（DSBs），因此不需要DNA供体模板，也不依赖于细胞同源定向修复（HDR）过程。由于碱基编辑器通常不诱导双链断裂，它们降低了DSB相关副产物形成的可能性。DNA碱基编辑器（BEs）由具有降低催化活性的Cas核酸酶与可在单链DNA（ssDNA）而非双链DNA（dsDNA）上发挥作用的碱基修饰酶融合而成。当碱基编辑器结合至DNA中的指定位置时，引导RNA与靶DNA链的配对导致一小段单链DNA被置换，形成“R-loop”。该单链DNA泡中的DNA碱基经受脱氨酶的修饰。为提高真核细胞中的效率，失活的核酸酶还切割非编辑DNA链，促使细胞利用编辑链作为模板修复未编辑链。已鉴定出两种类型的DNA碱基编辑器：胞嘧啶碱基编辑器（CBEs）将C-G碱基对转化为T-A碱基对；腺嘌呤碱基编辑器（ABEs）将A-T碱基对转化为G-C碱基对。CBEs和ABEs均能介导所有四种可能的转换突变类型（C至T、A至G、T至C和G至A）。在RNA中，也已开发了使用反义和Cas13引导的RNA靶向方法实现靶向腺苷转化为肌苷。
3.1.6. 引导编辑
2019年，Anzalone及其同事引入了引导编辑（PE），这是基因组编辑技术的一项突破，可实现所有12种碱基对到碱基对的转换、插入和缺失。与碱基编辑（BE）相比，PE提供了更高的靶向灵活性，消除了旁观者效应，并具有更广泛的编辑范围。虽然PE的编辑效率尚未达到BE的水平，但持续进展已将PE的效率提高至53.2%，使其成为各种应用的有前景工具。引导编辑器包含两个组分：包含Cas9切口酶（H840A突变）的逆转录酶（RT），该酶仅产生单链断裂；以及含有引物结合位点（PBS）和RT模板的3′延伸sgRNA，称为pegRNA。当PE系统在pegRNA引导下附着至靶DNA时，Cas9切口酶切割带有PAM的链，暴露其3′端羟基，并与pegRNA上的PBS结合，从而基于RT模板引导包含靶编辑的新DNA进行引物逆转录。在此过程结束时，修饰后的DNA链包含两个冗余悬突：一个未改变的5′瓣和一个预期的3′瓣。在这种情况下，可保留3′瓣而移除另一个。随后，带有编辑的悬突通过细胞DNA修复机制整合至指定位点。PE系统能够介导全范围的遗传修饰，包括点突变、插入和小片段缺失。与BE相比，它提供了更大的靶向灵活性，特别是在PAM位点与编辑位点之间的距离方面，同时最大限度地降低了旁观者编辑的风险。这些进展使PE成为通用精确的基因组编辑工具。
3.2. 玉米
玉米（Zea mays L.）是津巴布韦小农户主要生产的 staple 作物。它用于食品、饲料、饲草和工业用途，并已成为遗传改良广泛研究的对象。尽管其重要性，津巴布韦全国平均产量相对较低，为0.30至1.0吨/公顷，而国际产量超过6吨/公顷。津巴布韦玉米种子产业引入了多种改良品种，反映了对农业进步的承诺。该产业的成功主要归功于私营和公共实体之间的强有力伙伴关系，促进了农民获得改良品种。然而，迫切需要用气候智能型优良玉米品种取代旧品种。这些改良品种对于解决粮食安全、改善人类营养和显著促进减贫至关重要。基因编辑在改善玉米多种性状和解决其栽培中的特定挑战方面具有巨大潜力。主要生产限制因素包括干旱、土壤肥力低、热胁迫以及灰叶斑病、玉米条纹病毒等病害，以及秋粘虫和象鼻虫等害虫。津巴布韦马塔贝莱兰、马斯温戈和马绍纳兰省的小农玉米产量目前约为0.3吨/公顷，原因是干旱和热胁迫；这些农民可以从遗传修饰中受益。例如，编辑HSP101/70和ARGOS8基因分别用于热休克蛋白和耐旱性。热休克蛋白（HSPs）对于保护植物免受热诱导损伤至关重要，促进蛋白质折叠并抑制蛋白质变性，从而提高植物叶绿素含量和存活率。此外，其他研究重点包括抗氧化酶、光合作用相关的气孔调节和热响应信号通路基因。此外还有耐盐性、氮利用效率、病害、营养强化、雄性不育和昆虫（见表1）。例如，在肯尼亚，研究人员正在致力于编辑易感自交系以赋予对玉米致死性坏死病（MLN）的抗性。潜在策略包括抗虫性、易感性修饰、杀虫蛋白和信息素调控。CRISPR/Cas9等基因编辑工具的实施有可能通过简化劳动密集型过程、提高产量和改善种子纯度来变革玉米种子产业。
3.3. 小麦
津巴布韦的小麦生产在撒哈拉以南非洲（SSA）中表现突出，这得益于该国有利的生长条件。然而，该部门面临诸多挑战，包括气候变化、投入品成本上升以及干旱和高温等非生物胁迫强度增加，同时还有病害和害虫等生物挑战。高温和灌溉资源不足是雨养系统中的重要非生物限制因素。气候变化加剧了这些条件，生殖阶段的高温导致显著减产和籽粒品质差，这归因于生长阶段缩短、生物量减少、叶片过早衰老和不利的生理变化。为了解决这些问题，基因编辑技术为小麦育种提供了有前景的解决方案，能够对小麦基因组进行精确修饰，从而开发具有改良农艺性状和改善终端产品品质的新基因型。例如，编辑转录因子基因如OsDREBIC，可导致产量显著增加17.2%至22.6%，因为它促进更好的光合作用、提前开花和改善氮利用效率。小麦易感多种病害，包括锈病、白粉病和镰刀菌赤霉病。2Blades等倡议利用TALEN技术进行小麦锈病抗性的基因编辑。这种方法通过技术许可针对主要性状改良本地品种提供了机会（见表2）。
3.4. 高粱
高粱在非洲，特别是在津巴布韦，因其对粮食安全、生计和文化遗产的显著贡献而发挥着关键作用。这种多功能作物有多重用途，包括饲料、食品、饲草和燃料，并具有文化意义。高粱籽粒产量在0.3至0.8吨/公顷之间，而世界平均水平为2.1吨/公顷。作为一种韧性作物，高粱在干旱和半干旱地区茁壮生长，使其在水分有限的地区成为有价值的作物。然而，它受到干旱、高温和低土壤pH的影响。为提高生产力，可应用基因组编辑技术来应对独脚金、霜霉病、粒霉病、干旱、耐热性和营养强化等挑战。已记录了成功的应用，利用农杆菌和基因枪轰击等方法将CRISPR/Cas9和gRNA系统导入高粱植株。例如，对LGS1基因（负责产生强效独脚金刺激物5-脱氧独脚金醇）的修饰将其转化为具有相反立体化学的独脚金醇。在苏丹高粱中对LGS1基因进行CRISPR介导的敲除，在肯尼亚使独脚金侵染减少了70%，这展示了一种可应用于津巴布韦品种以提高 communal lands 生产力的模式。此外，还可以靶向stay-green基因以改善干旱和热胁迫耐受性。持续努力对于优化基因编辑过程至关重要。研究还表明，高粱中的基因编辑可涉及热休克蛋白和转运蛋白的修饰（见表1）。在津巴布韦的作物-牲畜系统中，常见的做法是种植专用双重用途作物，利用剩余生物质作为牲畜饲料。约70%的这种作物残留物来自玉米、高粱和豆类等谷物。然而，用于生产的品种主要侧重于籽粒产量，导致随后用作饲料的产量和品质下降。虽然作物残留物为牲畜提供了重要饲草，但其营养价值和品质往往不足。已采用多种方法通过利用基因编辑的褐色中脉（BMR）表型来提高高粱生物量生产，该表型可降低木质素含量并改善木质纤维素转化。这些BMR基因的表达与生物能源密切相关，导致生物量产量增加两倍。BMR性状已显示与非BMR品种相比，牲畜产奶量更高。此外，表1中还详细列出了可考虑对本地品种进行基因编辑的其他性状。
3.5. 马铃薯
马铃薯（Solanum tuberosum L.）具有多种用途，在全球粮食生产中享有盛誉。目前，按人类消费计，它是全球第三大重要粮食作物，仅次于小麦和水稻。在津巴布韦，马铃薯排名第三，仅次于玉米和小麦。马铃薯的需求正受到全球化、快餐连锁店和超市的兴起以及收入水平提高的推动。在过去二十年中，非洲的收获面积大幅增长。然而，总产量和收获面积仍远小于其他大陆。非洲马铃薯生产的主要增长归因于种植面积的大幅扩大，自1994年以来翻了一番多。认识到马铃薯生产和消费日益增长的重要性，津巴布韦政府于2012年5月18日将爱尔兰马铃薯指定为国家关键粮食安全作物。津巴布韦各生产系统之间的产量存在差异，从小规模重新安置到大规模商业生产系统，范围为8至35吨/公顷。商业生产区产量为45吨/公顷。影响马铃薯种植的几个关键因素包括生物和非生物压力，如蚜虫、螨虫、蛾类、疫病、细菌性枯萎病和马铃薯胞囊线虫等病虫害。此外，高温、干旱、养分缺乏、盐碱和寒冷/霜冻胁迫等非生物胁迫也起着重要作用。影响马铃薯的主要病害晚疫病，因日益严重的病毒威胁而加剧，这些病毒危及农民的健康种薯生产和产量。利用基因编辑靶向当前马铃薯品种中的StERF3基因，有望增强对晚疫病的抗性，并减少杀菌剂的使用。热和干旱胁迫是气候变化的重要后果，因此有效的管理对于通过加速育种策略开发气候适应型马铃薯品种至关重要。基因组编辑是产生具有理想基因组合的新型遗传变异的强效技术，并且由于马铃薯与组织培养的兼容性，已在该作物中记录了非生物胁迫、块茎品质性状和其他特性的成功应用。进一步的工作可能侧重于津巴布韦重要性状（表3），并考虑申请许可。
3.6. 大豆
大豆（Glycine max (L.) Merr.）在撒哈拉以南非洲（SSA）因其作为食品、饲料和工业原料的多种用途而具有重要性。在津巴布韦，大豆在支撑国家农业、经济和粮食安全的各个方面发挥着显著作用。包括津巴布韦在内的SSA地区平均产量多年来一直保持在约1.1吨/公顷不变，而全球平均水平为2.4吨/公顷。这种停滞归因于使用低产品种和农业投入品应用有限。自20世纪70年代以来，大豆生产一直是一个不断增长的业务，但该地区对国家经济的贡献受到气候因素的阻碍。大豆育种的关键性状包括荚裂荚、耐热性、生长习性、种子品质、耐旱性、耐盐性、耐涝性、虫害和叶部病害。在利用CRISPR/Cas9对荚裂荚基因进行基因编辑方面已取得重大进展（见表4），可将产量损失从99%降至19.8%。此外，针对耐旱候选基因的基因编辑与产量增加相关，通过控制株高、节间长度、叶面积和叶柄长度的减少，促进更紧凑的植株结构。锈病是影响大豆的主要生物威胁，影响林业和园艺等更广泛的农业部门。目前管理这些病害的策略包括结合农艺措施和植物保护方法；然而，杀菌剂的有效性因抗性而下降。最近的基因编辑进展已鉴定出抗锈病基因，以及提高蛋白质和油含量和改善生理性状，为津巴布韦大豆产业提供了未来选择（表4）。
3.7. 基因编辑作物的商业化过程
基因编辑作物的商业化涉及多年期的创新链过程，从实验室发现到品种注册和市场引入。该过程从性状发现和概念验证开始。此阶段的目标是验证编辑是否产生所需性状，如耐旱性或改善的营养品质。接下来是转化和组织培养，在此期间进行筛选以确保编辑稳定且无脱靶效应。随后是选择和表征、田间试验、法规提交和批准，最后是品种注册和商业化。在最后阶段，将基因编辑性状渗入商业高产品系，必须符合当地种子法案合规要求才能出售给农民。已有基因编辑作物进入市场的例子，如GABA番茄、小麦和大豆，许多产品仍处于不同研究阶段。
已有几项促进国家农业研究推广系统（NARES）使用基因编辑的倡议，津巴布韦可以采用，例如AATF与Bioheuris之间的合作伙伴关系，以提高非洲高粱、水稻和小麦基因编辑耐除草剂品种的生产力和采用率。Corteva与CIMMYT/KALRO之间的公私合作伙伴关系（PPPs）用于玉米致死性坏死病（MLN）。还有若干个人、联合许可和公私合作伙伴关系，其中专利由2Blades、Corteva和Bayer转让给非洲。PPPs降低了公共机构的研发成本和风险，并有助于处理私营公司持有的知识产权（IPR），从而加快向小农户提供改良作物。
3.8. 基因编辑监管方面的挑战
不同国家对基因编辑（GE）作物的监管框架存在差异，从严格到灵活的方法不等，这给全球贸易、创新和行业合规带来了重大挑战。这些不一致导致物流障碍、开发商成本增加和法律模糊性。异步审批过程导致贸易中断，包括货物被拒收、经济损失和市场不确定性。低水平存在问题通常导致货物销毁，特别是在对未经批准的生物技术作物采取零容忍的地区，造成市场准入碎片化和产品在多个地区分销的障碍。此外，可追溯性、检测、高合规成本和法律模糊性等技术复杂性和监管挑战进一步加剧了这种情况。这些复杂性也影响行业创新，为小型公司设置障碍，并阻碍有益性状的采用。此外，围绕公众信任和标签策略的挑战出现，因为将GE作物严格归类为GMO可能会降低消费者接受度。试图规避监管程序可能引发负面公众看法，类似于早期GMO争议。可行的解决方案将是协调基因编辑作物法规。
3.9. 国际法规
不同国家对基因编辑作物采取了不同的监管方法。美国、加拿大、日本、阿根廷、巴西和洪都拉斯等国家基于逐案方法制定了类似法规。新西兰和欧盟裁定所有源自基因编辑的产品均被归类为GMO，类似于南非。在非洲，肯尼亚、加纳、马拉维和尼日利亚等国已开始以逐案方式监管基因编辑作物。另一方面，欧盟选择通过基于过程的监管框架将基因编辑作物作为GMO进行监管。在基因编辑方面取得重大进展的印度，出现了逐案评估的趋势。例如，中国在2014年至2017年期间在专利申请方面处于领先地位，并实施了GMO监测系统。鉴于这些新育种技术和相应的监管框架，越来越多的人认为非洲国家将从制定协调一致的方法中受益。基因编辑法规的协调将导致可持续农业发展，因此需要全球合作和共识。不同国家和地区的植物基因组编辑法规各不相同，反映了风险评估、公众咨询和标签的不同方法。如《卡塔赫纳生物安全议定书》等国际协议为解决与转基因生物相关的生物安全问题提供了更广泛的框架。随着基因组编辑领域的继续发展，监管框架可能会随着科学发展和社会关切而演变，在创新与安全和伦理考虑之间取得平衡。
3.10. 津巴布韦和非洲的基因组编辑监管框架
非洲已开始利用基因编辑应对农业中的持续挑战，包括低作物产量、虫害和气候变化，如表5所示。这些发展标志着向利用尖端生物技术保障大陆粮食安全的转变。津巴布韦可以从这些倡议中吸取宝贵教训（表5）。监管准备、利益相关者参与和对当地生物技术能力的投资是关键。例如，肯尼亚的科学支持政策和生物安全框架促进了生物技术作物的快速田间试验和商业化。同样，尼日利亚的监管开放性使其能够在国家生物安全管理机构下快速批准基因编辑作物。该国已接受基因编辑和转基因生物（GMOs）作物，以增加农业产出、改善人类健康和推进科学研究。为了保护环境和公共健康，津巴布韦已开始制定有关创新生物技术实践（如基因组编辑和转基因作物）的立法。与大多数非洲国家一样，津巴布韦、肯尼亚、尼日利亚和乌干达正在以逐案为基础开展工作。因此，津巴布韦政府参与了非洲联盟发展机构（AUDA-NEPAD）基因组编辑项目。该项目为津巴布韦制定《津巴布韦基因组编辑沟通和宣传战略》提供了技术和财政支持，该战略即将启动。此外，《基因组编辑监管流程指南》也已起草。该指南将在国家生物技术管理局董事会批准后发布（2006年《国家生物技术管理局法案》[第14:31章]）。这些法规符合非洲联盟、贸易和区域协调协议，有效管理基因编辑规程。
3.11. 可能的伦理问题
对非洲基因编辑技术的概述引起了若干伦理关切，包括对基因编辑产品进行标签的需求、文化习俗和信仰，以及过去参与的经验教训。有必要通过制定明确法规来解决种子主权问题，保护农民保存和交换种子的权利，确保他们能够获得基因编辑品种而不侵犯植物育种者权利。传统非洲体系内的决策结构也影响这些技术的接受度。在非洲成功实施基因编辑需要应对各种宗教、文化和跨学科观点。这可能包括尊重传统知识和实践的咨询，确保农民了解使用此类作物的益处和影响。为解决这些伦理关切，必须采取具有社会意识且全面的策略，促进透明度、利益公平分配、对生物多样性的考虑、农业生态生产以及社区的积极参与。此外，必须制定健全的监管政策，通过支持非洲合乎伦理和负责任的基因编辑研究的民间伙伴关系建立信任。
