酸性低复杂度结构域截短调控凝聚态及阳离子蛋白诱导的形态重组

《Colloids and Surfaces B: Biointerfaces》：Acidic Low-Complexity Domain Truncation Modulates Coacervation and Cationic Protein-Induced Morphological Reorganization

　　

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  酸性LCD截短可调节依赖于pH和盐的简单凝聚行为。
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  截短会改变与溶菌酶复合凝聚的比例窗口。
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  酸性LCD长度可调节bhBMP-2诱导的界面重组。
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  凝聚液滴形成与界面重组在一定程度上可分离。
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  序列组成共同影响体相凝聚和界面形貌。

引言

蛋白凝聚体是通过生物大分子的自缔合或缔合相互作用形成的水相凝聚相。由于这些液滴来源于生物大分子并以分散的胶体相存在于水中，它们为在生物学相关条件下研究胶体稳定性、相分离和界面组织提供了有用的模型体系[1], [2]。凝聚作用，包括简单凝聚和复合凝聚，可通过pH、离子强度、大分子组成和混合化学计量进行调控[2], [3]。因此，蛋白凝聚体不仅有助于理解液-液相分离（LLPS），也有利于开发软生物分子区室和与生物界面相关的材料[1], [4]。

本征无序蛋白（IDPs）和低复杂度结构域（LCDs）是许多生物分子凝聚体的重要组成成分，因为其柔性链可提供多价弱相互作用[5], [6]。这些蛋白的相行为受序列特征影响，包括净电荷、电荷密度、电荷排布、疏水性、链长以及特定的非静电相互作用基序[5], [7]。特别地，酸性残基和碱性残基控制随pH和盐浓度变化的静电排斥和吸引，而芳香族或脂肪族残基可提供额外的内聚相互作用[7], [8], [9]。这些序列特征不仅影响球形液滴的形成，还影响凝聚相的胶体稳定性和内部组织。

在我们先前的研究中，我们开发了GG1234作为基于蛋白的蛋白凝聚体的合成阴离子蛋白平台[10], [11], [12]。GG1234富含甘氨酸、天冬氨酸和丝氨酸，其灵感来源于参与生物矿化的酸性壳基质蛋白。GG1234在酸性条件下形成球形简单凝聚体。此外，将生物工程化的人BMP-2（bhBMP-2）加入预形成的GG1234凝聚体中，诱导了液滴向类囊泡的形貌转变。这一先前的结果表明，预形成的阴离子蛋白凝聚体在与阳离子蛋白伴侣相互作用时可发生界面重组。相关的空心结构和核-壳凝聚体也作为层级相组织的不同形式被报道，但其底层路径有所不同。在大豆球蛋白和动力学猝灭凝聚体中，富含大分子的相在已有的密相内部形成[13], [14]，而多相复合凝聚体则通过组成不同的密相共存和润湿来组织[15]。GG1234/bhBMP-2的转变与上述两者均不同，因为bhBMP-2由连续相提供，我们此前提出其促进表面导向的复杂化作用并在预形成GG1234凝聚体的界面形成壳层[10]。因此，这些研究为层级凝聚体组织提供了更广泛的背景，而非与我们的体系共享单一机制。然而，该研究仅为单一全长蛋白建立了该现象；它未探讨酸性结构域本身如何贡献于这种行为。因此，该平台中酸性结构域截短如何影响pH和盐依赖的凝聚、与阳离子蛋白的复合凝聚以及bhBMP-2诱导的形貌变化仍不清楚。

在这里，我们使用GG1234和两个截短变体GG12-2、GG12-1作为相关的蛋白组，考察酸性结构域截短对蛋白凝聚体行为的影响。三种蛋白共享保守的N端片段，但在C端酸性LCD的长度和组成上不同。我们首先比较了它们随pH和醋酸钠浓度变化的表观简单凝聚行为。然后我们考察了以溶菌酶作为模型阳离子蛋白时依赖比例的复合凝聚。最后，我们在固定配方下评估了预形成简单凝聚体的bhBMP-2诱导界面重组。在本研究中，浊度数据被解释为在混合后采用相同样品处理和测量时间所得到的表观高浊度区域，而非平衡相图。由于截短同时改变了酸性残基含量、链长以及远端含Tyr/Ile的基序，观察到的差异被讨论为GG1234衍生平台内的序列截短效应。这一比较提供了从胶体层面描述酸性结构域截短如何共同影响合成阴离子蛋白凝聚体的表观相行为和蛋白诱导的界面形貌。

章节摘要

菌株与载体构建

除特别说明外，所有化学品和缓冲液试剂均为试剂级或更高纯度，购自美国Sigma-Aldrich公司。大肠杆菌DH5α（Life Technologies，美国加州卡尔斯巴德）和BL21（DE3）（Merck KGaA，德国）被用作重组载体构建以及GG1234及其截短片段（GG12-1和GG12-2）表达的宿主细胞。GG12-1和GG12-2基因是通过聚合酶链反应（PCR）基于先前报道的GG1234基因序列构建的。

GG1234及其截短变体的序列衍生特征

GG1234、GG12-2和GG12-1被制备为具有不同C端酸性低复杂度结构域（LCD）截短长度的相关合成阴离子蛋白组（图1和表1）。三种构建体共享保守的N端片段（79个残基）和C端His₆标签，但在酸性C端区域的长度和组成上不同。保守的N端片段在组成上比酸性LCD更复杂，富含Ala/Glu/Val残基。它

结论

在本研究中，我们考察了在GG1234衍生的阴离子蛋白平台中，渐进性酸性LCD截短如何调节表观凝聚窗口和bhBMP-2诱导的界面重组。从GG1234到GG12-2和GG12-1的截短降低了酸性价态，提高了预测的等电点，并使简单凝聚向更高pH偏移，同时在酸性条件下仍保留液滴形成能力。简单凝聚还表现出非单调的离子强度依赖性，表明

CRediT作者贡献声明

Jaemin Han：撰写 – 原稿，验证，方法学，调查，形式化分析。Yoo Seong Choi：撰写 – 审阅与编辑，撰写 – 原稿，监督，方法学，形式化分析，概念化。Hyunsuk Choi：验证，方法学，调查，形式化分析。

利益冲突声明

作者声明他们没有任何已知的竞争财务利益或个人关系可能影响本文所报告的工作。

致谢

本工作由韩国政府（MSIT）资助的国家研究基金会（NRF）生物与医药技术发展计划支持（项目编号：RS-2025-24523548），并由韩国政府（科学技术信息部）资助的韩国国家研究基金会（NRF）拨款支持（项目编号：RS-2025-02303659）。

Jaemin Han|Hyunsuk Choi|Yoo Seong Choi