在Kluyveromyces marxianus的非酒精发酵过程中，石榴（Punica granatum L.）果汁中的糖分降低及其相关的生化变化

《Food Chemistry》：Sugar reduction and associated biochemical changes in pomegranate ( Punica granatum L.) fruit juice during non-alcoholic fermentation by Kluyveromyces marxianus

　　

• •
  从开菲尔颗粒中分离出一种克雷布斯树阴性发酵酵母 K. marxianus。
• •
  使用 K. marxianus 发酵后，石榴汁中的糖分减少了34%。
• •
  发酵过程增强了酯类的形成，提高了整体果味感知。
• •
  发酵过程中增加了B族维生素的含量，同时保留了有机酸和花青素。

引言

石榴（Punica granatum L.）果汁是糖分、维生素、生物活性植物化学物质花青素、有机酸和其他抗氧化剂的极佳来源（Asgary等，2014；Henning等，2017）。此外，其高水分含量也提升了其口感和补水效果。这些营养成分以及潜在的健康益处，使得全球对石榴汁作为更健康饮品的需求不断增长（Kandylis & Kokkinomagoulos，2020）。然而，由于石榴汁中含有较高比例的糖分（约13%），过量饮用可能导致血糖飙升、血糖控制受损、2型糖尿病风险增加以及体重增加（Kumar等，2022；Wolever等，1993）。世界卫生组织建议将游离糖的摄入量限制在总能量摄入量的10%以内（WHO，2015）。因此，降低果汁中的糖分含量受到了广泛关注。为此，研究人员采用了多种方法。混合不同水果和蔬菜的果汁是一种方便的方式，至少可以减少30%的糖分。虽然这种方法能保留原有营养成分，但混合过程中风味会发生变化，酸度或苦味也会根据果汁成分的不同而有所调整（Karim等，2020）。然而，混合方法有时会失去水果的天然特性，并可能引发消化问题（Karim等，2020）。而非酒精发酵则能产生新的有益香气化合物（Karim等，2020）。膜分离技术（微滤、超滤和纳滤）也被用于选择性去除糖分，但这些方法会同时去除其他营养成分，从而影响整体品质（Satyannarayana等，2023；Uro?evi?等，2017）。膜过滤会去除分子大小相近的维生素和矿物质，而非酒精发酵过程中，酵母虽然会消耗部分营养成分，但也能合成B族维生素。膜过滤后的果汁澄清且稀释，而非酒精发酵后的果汁则具有更复杂的风味。使用固定化酶进行特定糖分的生物转化也被研究过，但长期使用会导致转化效率逐渐下降（Cywińska-Antonik等，2023；Maghraby等，2023）。与生物转化不同，非酒精发酵可以直接去除果汁中的糖分。生物转化通常会因使用特定酶而改变果汁的味道，而非酒精发酵则通过合成新的芳香化合物来赋予果汁风味。另一种生物转化方法是通过微生物将糖分转化为低热量糖类（山梨醇或甘露醇），但这可能带来胃肠道不适（Cao等，2022）。生物转化通常在较短时间内完成一个或两个催化步骤，而非酒精发酵则涉及更多酶促步骤并消耗糖分。与非酒精发酵相比，非酒精发酵方法更具成本效益且易于规模化。在包括混合、膜分离、酶促生物转化和非酒精发酵在内的多种方法中，后者通过消耗糖分几乎可以完全去除糖分，并产生新的香气和营养成分（Dygas等，2021）。使用酵母进行常规发酵可以实现50–100%的糖分减少和风味提升，而膜过滤和酶促方法分别为30–60%和40–80%，但后者存在酒精管理的挑战（Cywińska-Antonik等，2023）。在这些方法中，非酒精发酵能够在不改变主要代谢物的情况下降低糖分并提升果汁品质（Dygas等，2021）。非酒精发酵所用的微生物包括酵母和乳酸菌（LAB），可单独使用或联合使用。开菲尔颗粒是一种乳酸菌和酵母的共生培养物，之前已被用于牛奶和果汁的发酵（Chen等，2019）。有研究显示，从开菲尔颗粒中分离出的乳酸菌仅能减少25%的糖分（Mantzourani等，2022），主要用于制备益生菌健康饮品。然而，尚未有研究探讨利用开菲尔颗粒制备低糖果汁。此外，开菲尔发酵还可减少橙汁和柑橘类饮料中的乙醇含量（<0.5%）（Kazakos等，2016）。开菲尔发酵菌株适应性强，尤其是对酸性果汁较为适宜。开菲尔颗粒中的酵母生长特征包括能够利用多种碳源、广耐温范围以及克雷布斯树阴性（呼吸发酵）代谢类型（Mantzourani等，2022）。尽管如此，利用开菲尔颗粒生产低糖果汁（>30%）且不产生酒精的研究仍较少。本研究基于以下假设：开菲尔颗粒中的特定酵母菌株（尤其是克雷布斯树阴性酵母）可通过控制呼吸发酵代谢降低石榴汁中的糖分（果糖和葡萄糖）至30%，同时使乙醇残留浓度低于0.5%（v/v），符合欧洲法规标准。基于此假设，本研究尝试利用开菲尔颗粒中的微生物优化发酵工艺，以实现低糖（<30%）石榴汁的生产。根据欧盟法规，如果石榴汁的糖分含量比新鲜石榴汁低30%以上，则可作为低糖果汁标注（欧盟法规EC No 1924/2006）。美国食品药品监督管理局（FDA）也规定，乙醇含量低于0.5%的饮料属于“非酒精”饮料（US FDA，2005）。本研究旨在利用从开菲尔颗粒中分离出的微生物，优化发酵工艺，实现石榴汁中30%的糖分降低和低于0.5%的乙醇残留（符合欧盟低糖果汁标准）。

部分摘要

化学品和试剂

马铃薯葡萄糖肉汤、马铃薯葡萄糖琼脂、碳酸钠、葡萄糖、果糖、磷酸二氢钠、磷酸二钠、氯化铁、磷酸、甘油、番红花红和氯化钠均购自印度Himedia公司。2,2-二苯基-1-吡喃肼基、甲醇、特罗洛克斯、铁氰化钾、三氯乙酸、冰醋酸、乙腈和乙醇均购自美国Sigma公司。氰苷-3,5-二葡萄糖苷、顺-2,反-6-壬二烯-1-醇、生物查宁A、草酸等试剂亦来自Sigma公司。

用于发酵的石榴汁

当地有三种新鲜石榴品种（Bhagwa、Bhagwa Super和Ganesh），经过筛选后选择适合榨汁和发酵的品种。然而，Ganesh品种的果汁颜色较浅（淡红色），不如Bhagwa和Bhagwa Super品种。Bhagwa和Bhagwa Super品种仅在大小上有所差异，其余参数（糖分含量35±2%和pH值3.4±0.2）相似。

结论

本研究通过K. marxianus的呼吸发酵降低了石榴汁中的糖分，同时增加了维生素（泛酸和生物素）和风味。显著的糖分降低（>30%）和有限的乙醇生成（<0.5%）使该发酵果汁符合欧盟和FSSAI的低糖果汁标准。研究还表明，有机酸含量未受影响。

作者贡献声明

Tanmayee Sharma： 负责撰写初稿、方法论设计、数据整理。Vanshika Adiani： 负责撰写初稿、方法论设计、数据整理。Rupali Ambolikar： 方法论设计、数据整理。Sumit Gupta： 负责撰写、编辑、监督和概念规划。Bibhuti Bhusan Mishra： 负责撰写、编辑、验证和监督。

https://www.fssai.gov.in/upload/uploadfiles/files/Compendium_Alcoholic_Beverages_Regulations_04_03_2021.pdf，日期不详

Mantzourani等，2018

Oyedeji等，2021

Pardini和Argoudelis，1968

欧盟法规（EC），2025

美国食品药品监督管理局（FDA），2005年

世界卫生组织（WHO），2015

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。

致谢

作者感谢FTD和BARC的Yeole Patyam S V女士以及项目实习生Shri Prathamesh Shelar在技术上的帮助。本研究得到了Bhabha原子研究中心的资助。

Tanmayee Sharma|Vanshika Adiani|Rupali Ambolikar|Sumit Gupta|Bibhuti Bhusan Mishra