4-磺基苯重氮盐：一种用于酚类化合物定量测定的新型、精确且选择性强的福林-酚法替代方法

《Food Chemistry》：4-Sulfophenyl diazonium salt, a new, precise and selective alternative to the Folin–Ciocalteu method for the quantification of phenolic compounds

　　

摘要

定量测定总酚类化合物（TPC）在食品和农业科学中至关重要。尽管Folin–Ciocalteu（F–C）法具有多功能性和广泛的可靠性，但在复杂基质中，非酚类还原剂会显著产生干扰。重氮盐对芳香族亲电取代反应具有高度选择性，仅与酚类衍生物和苯胺发生反应。本研究调查了4-磺基苯基重氮盐（4SPD）用于TPC定量测定的应用。4SPD的合成方法为：用亚硝酸钠和盐酸对对氨基苯磺酸进行重氮化，并通过1H NMR、FT-IR光谱和LC–MS进行表征。以没食子酸（40–400 mg L?1）构建校准曲线，定量限为3 mg L?1。在水-甲醇（50%甲醇）体系中可观察到工作信号。该方法表现出优异的精确度、准确性和稳健性，回收率与100%无显著偏差。在多种简单和复杂基质中验证，与HPLC-DAD的相关性R2 = 0.933，4SPD被证明是一种选择性、精确且稳健的TPC定量方法。

引言

酚类化合物被公认为水果、蔬菜和谷物中抗氧化能力的主要次生代谢产物群之一（Gutiérrez-Grijalva等，2016）。总可溶性酚类化合物（TSPC）的定量测定广泛应用于基因型选择、成熟阶段评价、储存条件研究、生物活性成分开发以及提取工艺优化等方面，旨在生产具有高水平抗氧化潜力的功能性食品和提取物。在此背景下，具有精确性、简便性，且最重要的是具有选择性的分析方法对于酚类化合物的测定至关重要（Custodio-Mendoza等，2024；Julkunen-Tiitto，1985；Shahidi & Ambigaipalan，2015）。

Folin–Ciocalteu（F–C）法是最广泛用于测定食品基质和生物样品中总可溶性酚类化合物（TSPC）含量的比色法之一。该技术依赖于F–C试剂与酚类化合物之间的电子转移反应，可有效测量样品的还原性（抗氧化）能力。由于其可靠性，该方法已成为定量测定植物来源食品和生物标本中总酚/多酚含量的标准工具（Lamuela-Raventós，2018；Singleton等，1999）。

F–C试剂由钨磷酸（H?PW??O??）和钼磷酸（H?PMo??O??）组成的复杂混合物构成，它们在碱性介质（pH ≈ 10）中充当氧化剂，生成在约765 nm处具有最大吸收强度的深蓝色发色团。尽管应用广泛，但F–C试剂的确切化学结构和完整的反应机制至今尚未完全阐明（Pérez等，2023）。

F–C法的主要局限之一是其化学特异性较低。当应用于果汁、植物提取物或粉末等复杂基质时，各种非酚类组分包括抗坏血酸、葡萄糖、果糖、亚硫酸盐、氨基酸和有机酸等可作为还原剂与F–C试剂反应（Andrés-Lacueva等，2009；Medina，2011；Pérez等，2023）。这些干扰导致实际TSPC含量的过高估计，从而降低了测量的准确性并限制了其可解释性，尤其是在比较化学组成不同的样品时（Andrés-Lacueva等，2009；Lamuela-Raventós，2018；Medina，2011；Pérez等，2023；Shahidi & Ambigaipalan，2015）。

尽管存在这些局限性，F–C值仍常被用作植物提取物和食品产品整体还原能力的间接估计值，而非作为酚类化合物含量的严格选择性测量手段（Huang等，2005）。这种做法得到了F–C结果与DPPH（r = 0.978）、ABTS（r = 0.951）以及铁离子还原抗氧化力（FRAP）法（r = 0.989）结果之间高相关性的支持（Abramovi?等，2018）。然而，由于所有这些方法均采用类似的电子转移（氧化还原）机制，这种相关性反映的是化学特异性的共同缺乏，而非证实F–C法对酚类化合物的选择性。因此，需要开发更加选择性的分析方法，以独立于一般氧化还原或抗氧化能力来定量测定酚类化合物，这一需求仍然十分明显。

当需要对TSPC进行定性和定量表征时，高效液相色谱联用质谱（HPLC–MS）无疑是可用最强大的分析技术，几乎适用于任何类型的基质（Dhole等，2012）。该方法将高分离效率与优异的选择性、灵敏度和精确度相结合，有效减少了基质干扰。然而，高昂的购置和维护成本以及许多实验室中此类仪器的有限可及性，限制了其常规应用。因此，开发替代方法，特别是更易于获取且具有成本效益的光谱法方法，仍然非常重要，尤其对于资源有限的研究团队而言（Lama-Mu?oz & Contreras，2022）。

在这方面，紫外-可见光谱法由于分析快速、操作简便、重现性好以及仪器要求相对简单，在科学研究和工业应用（食品、饮料、原料和营养保健品质量控制）中仍被广泛使用（Prior等，2005）。这些方法允许分析固体和液体样品，减少了对单独分析标准品的需求，并提供了较短的响应时间，使其成为估算TSPC含量的理想工具（Apak等，2016）。

近年来，提出了基于不同于F–C法中氧化还原反应过程的其他反应机制的TSPC测定替代方法，旨在提高分析选择性。在这些方法中，基于偶氮偶合反应的方法引起了关注，因为它们依赖于重氮盐与活化芳环之间的亲电芳香取代反应。此前的研究报告了一种基于重氮盐亲电芳香取代的偶氮偶合反应分析方法（Medina，2011）。

该方法利用了重氮盐作为弱亲电试剂，选择性地与含有酚基等活化芳环系统反应的特性（Morrison & Boyd，1998；Wade，2012）。Medina（2011）开发的方法采用了Fast Blue BB试剂，这是4-氨基-2,5-二乙氧基苯胺酰副胺的重氮化锌双重盐。在该反应中，在强碱性介质（pH ≈ 12）下进行，酚氧负离子活化芳环，使能形成在420 nm处具有最大吸收的偶氮染料（Medina，2011）。尽管该方法已被证明在TSPC定量测定中有效且具有选择性，但它存在某些实际局限性（Mo等，2021）。一些偶氮偶合产物由于其高分子量和极性而倾向于沉淀，重氮盐推荐在极低温（?20 °C）下储存，这使其使用和保存变得复杂（Roglans等，2006）。此外，该试剂的相对高分子量（312.13 g mol?1）和分子尺寸可能引入空间位阻效应，降低亲电芳香取代反应中的偶合效率（Smith，2025；Smo?ka & Krukiewicz，2023）。

因此，本研究的目的是开发一种基于对氨基苯磺酸重氮化盐（4SPD）的光谱法方法，用于TSPC的精确、准确、可重复且具有选择性的测定。具体而言，本研究旨在确认4SPD与代表性酚类化合物之间偶氮键（ArN=NAr）的形成，评估所开发方法的稳健性，并将所得结果与HPLC和F–C法的结果进行关联。

材料

本研究中使用的所有溶剂和试剂均为分析纯级，符合美国化学学会（ACS）的规格要求。所用试剂如下：对氨基苯磺酸（251,917，≥99%）、亚硝酸钠（S2252，≥99.0%）、盐酸（320,331，37%）、没食子酸（G7384，97.5–102.5%）、氢氧化钠（S5881，≥98%）、氢氧化钾（484,016，90%）、碳酸钠（223,530，≥99.5%）和甲醇（322,415，≥99.8%）。所有化学品均由Sigma-Aldrich提供。

4-磺基苯基重氮盐的合成

对氨基苯磺酸的1H NMR谱图（图2-A）显示两组以多重峰形式出现、分别位于7.88和7.45 ppm处的信号，对应于1,4-二取代芳环典型的AA'XX'自旋体系中的四个芳香质子。位于磺酸基邻位的质子（H?/H?）由于-SO??基团的吸电子诱导效应（I）而更加去屏蔽（7.88 ppm），而位于氨基邻位的质子（H?/H?）则在较高场（7.45 ppm）共振，这是

结论

本文开发的4SPD重氮盐方法通过亲电芳香取代实现酚类化合物的选择性测定，这与Folin–Ciocalteu法非特异性的氧化还原机制有本质区别。光谱确认（NMR、FT-IR和LC–MS）了偶氮发色团的形成，证明分析响应在化学上被限制在具有亲核位点的活化芳香体系中。验证确认了线性（r = 0.999）、精确度（RSD < 5%）、准确性

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CRediT作者贡献声明

Emilio Pi?a Betancourt：撰写–审阅与编辑、撰写–原稿撰写、可视化、验证、软件、资源、项目管理、方法论、调查、形式分析、数据整理、概念化。Ivanka E. Ramírez de la Cruz：撰写–原稿撰写、可视化、方法论、调查、形式分析、概念化。Manuel A. Reyes Rodríguez：撰写–审阅与编辑、验证、方法论、调查、数据整理、概念化。José

资助

本研究部分由墨西哥国家技术学院（Tecnológico Nacional de México）梅里达理工学院（Instituto Tecnológico de Mérida）资助。

未引用参考文献

Anslyn和Dougherty，2006；Bautista-Hernández等，2021；Bystrom, Lewis, Brown, Rodriguez和Obendorf，2008；Castro-López等，2019；Cirlini等，2016；Conde-Hernández, Espinosa-Victoria和Guerrero-Beltrán，2017；Fernández-Cabal, Avilés-Betanzos, Cauich-Rodríguez, Ramírez-Sucre和Rodríguez-Buenfil，2025；Gull等，2012；Gurung, Baral, Parajuli, Dhami和Ghimire，2022；Gutiérrez-Sánchez, Aguilar-Zárate, Michel-Michel, Ascacio-Valdés和Reyes-Munguía，2022；Khamphasan等，2018；Kuti和Kuti。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本论文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢CINVESTAV Mérida分析服务单元提供1H NMR服务。我们还感谢尤卡坦州科学研究中心（CICY）在FT–IR分析方面提供的帮助。我们衷心感谢Gabriel Olvera Aguirre博士捐赠本研究使用的植物基质。最后，我们对ITM的Jorge Antonio Jacobo Solís和USTA-ICTAN的Inmaculada álvarez Acero在实验期间的宝贵支持表示极度感激。

Emilio Pi?a Betancourt | Ivanka E. Ramírez de la Cruz | Manuel A. Reyes Rodríguez | José M. Cervantes Uc | Víctor M. Moo Huchin | Sonia de Pascual-Teresa | Enrique Sauri Duch