使用原子级分辨模型对豌豆豆科植物在热诱导下的结构变化进行了研究

《Food Hydrocolloids》：A structural study of the heat-induced changes of pea legumin using atomic-resolution models

　　

摘要

采用高分辨率模型对豌豆中的主要储存蛋白——豌豆球蛋白进行了结构研究，使用的方法包括同步辐射圆二色光谱（SR-CD）和小角X射线散射（SAXS）。通过选择性沉淀豌豆粉提取物获得了一种球蛋白，并对其在加热处理前后的结构进行了研究。为了确定由于脂质存在而可能产生的结构差异，从脱脂或未脱脂的豌豆蛋白浓缩物中提取了球蛋白，或者随后添加了富含磷脂酰胆碱的脂质组分。无论是否存在脂质，球蛋白都表现出高度的α-螺旋和β-折叠结构。室温下的SAXS数据可以通过线性组合来描述，这些组合包含了来自球蛋白AlphaFold3模型的六聚体和三聚体结构的散射，同时考虑了弱非特异性相互作用。从脱脂和未脱脂面粉中提取的球蛋白以及与外源脂质混合的球蛋白的结构特征是相同的。原位圆二色光谱显示，在60°C时开始发生变性，即从天然结构向变性状态的转变，并在77°C时完成。CD数据还表明，在变性温度以上，蛋白质仍包含折叠良好的结构域。SAXS实验显示，在大约50°C时，散射强度的下降已经很明显且逐渐进行。在60°C以上，SAXS数据可以通过未折叠单体结构与一个结构因子来描述，该结构因子考虑了明显的聚集现象。这项高分辨率研究提供了对球蛋白热诱导结构变化的详细且内部一致性的描述。涉及预测高分辨率结构和考虑聚集效应的结构因子的SAXS建模方法极大地增强了我们对蛋白质 unfolding 和聚集机制的理解，揭示了从天然寡聚体到未折叠和聚集状态之间的协同转变。重要的是，研究结果表明，脂质分子的存在并不会显著改变球蛋白的热稳定性或结构演变，从而支持其作为食品成分的稳定性。

引言

豌豆蛋白被认为是一种有前景的、营养丰富且可持续的食品成分。然而，为了更好地预测其加工性能，需要对其结构进行全面评估。豌豆中的主要蛋白质是储存球蛋白，它们占种子总蛋白质的60%以上（Gravel & Doyen, 2023）。球蛋白主要由球蛋白和vicilin组成，具体比例因基因型而异。已知它们的溶解度受pH值和离子强度的影响（Zhang, Roman等人，2025）。

球蛋白通常以六聚体的形式存在，分子量在320到400 kDa之间，因为它们由不同的变体组成。每个六聚体包含六个亚单位，每个亚单位的大小约为60–65 kDa，主要通过H键连接，包括一个酸性区域（约40 kDa）和一个碱性区域（约20 kDa），两者通过二硫键相连（Vreeke等人，2023）。这些不同的遗传变异体已在开放获取的UniProt数据库中进行了测序和编目，其中最丰富的单体包括Legumin A1（P02857）、Legumin A2（P15838）、Legumin B（P14594）、Legumin J（P05692）和Legumin K（P05693）（Rayner等人，2024；Vreeke等人，2023）。

先前对含有不同比例球蛋白和vicilin的球蛋白分离物的研究表明，这两种蛋白质具有非常不同的性质，其中球蛋白的凝胶化和乳化能力较低，而vicilin则以三聚体的形式存在（Husband等人，2024）。球蛋白在高离子强度（>0.3 M）下是可溶的（Zhang, Roman等人，2025），其变性温度范围为74至85°C（O'Kane等人，2004；Shand等人，2007）。这种温度范围是由于样品纯度低、测试条件不同（包括浓度效应），以及最重要的，遗传变异体差异造成的。球蛋白通常通过酸性沉淀法制备，这会导致分离物中含有脂质，这对蛋白质的溶解性和界面性质有重要影响（At?l等人，2025）。例如，蛋白质制备中的脂质存在被认为可能影响球蛋白的热性质（Keuleyan等人，2023）。因此，需要对球蛋白的结构特征进行全面评估，研究从脱脂或未脱脂豌豆粉中提取的球蛋白之间的差异，以及脂质存在对蛋白质热性质的潜在影响。

利用圆二色光谱（CD）对豌豆蛋白分离物进行了研究（Zhang, Jones等人，2025），以了解在不同环境刺激下pH值变化或加热后的结构变化。使用FTIR还评估了含50%水分的豌豆蛋白分离物的二级结构特征，结果显示结构域在加热时展开，在冷却时重新排列为β-结构（Nakagawa & Ubbink，2025）。然而，这些结果代表了不同蛋白质的集合，因此在分子水平上的解释是一个挑战。使用FTIR还报道了vicilin富集部分和球蛋白富集部分之间的二级结构差异（Husband等人，2024）。虽然β-折叠和β-转角是vicilin分离物的主要结构特征，但球蛋白富集部分表现出更高的α-螺旋比例。

本研究旨在通过结合使用小角X射线散射（SAXS）和CD光谱这两种互补技术，进一步阐明球蛋白的分子结构及其随温度变化的修饰。最近，已经应用AlphaFold进行结构预测来分析蛋白质溶液的SAXS数据。通过使用AlphaFold3创建先验模型（Abramson等人，2024），可以研究更复杂的蛋白质结构（Pal等人，2026）。这种方法已被用于评估表面活性剂对蛋白质结构的影响（López Hernández等人，2025），以及研究从豌豆白蛋白中通过加热纯化的PA1和PA2两个主要组分的热诱导结构变化（Li等人，2026；Li等人，2025）。在本研究中，从脱脂和未脱脂面粉中提取了球蛋白分离物，以检查提取过程中的潜在差异以及脂质存在对其结构性质的影响。特别关注了脂质存在对缓解热变性和聚集的潜力。为了进一步验证这一点，还将从脱脂面粉中提取的球蛋白与富含磷脂酰胆碱的脂质组分混合。更好地理解这些球蛋白分离物的热性质将提供有关豌豆蛋白质的技术和功能特性的重要信息，以及它们作为食品成分的潜在用途。

节选

蛋白质制备

豌豆蛋白分离物是从磨碎并经过空气分离的豌豆蛋白浓缩物（F55X，Vestkorn，挪威）中提取的。豆磷脂酰胆碱（SoyPC）的纯度超过95%，购自Avanti Polar Lipids（美国）。研究中使用的所有其他化学品均来自Sigma-Aldrich，均为分析级或更高级别。

为了去除脂质，使用1.5升Folch溶剂（氯仿:甲醇（2:1 v/v）以1:15（w/v）的比例提取了100克豌豆蛋白浓缩物粉末。

25°C下的结构分析

无论样本经过何种处理，所有球蛋白在SR-CD光谱中都显示出相似的结构特征，最大值在190 nm，最小值在210 nm左右（图S2），这与先前的研究结果一致（At?l等人，2025）。这些特征是具有α-螺旋和β-折叠区域的有序结构的典型表现（Hoffmann等人，2016）。所有三种球蛋白样本，无论是否含有脂质或是否经过面粉脱脂处理，都表现出相似的二级结构。

结论

本研究通过整合SR-CD、SAXS和基于AlphaFold3的建模方法，提供了对豌豆球蛋白的详细且一致的结构描述。在室温下，球蛋白以三聚体和六聚体的形式存在，各个组成单位之间存在弱的非特异性结合，这种组织形式不受脱脂或脂质存在的影响。

温度依赖性测量显示出了协同转变。SR-CD表明，在一定温度范围内，二级结构得到了很好的保留。

CRediT作者贡献声明

S?ren Hoffman： 撰写 – 审稿与编辑、软件、资源协调、资金获取。Milena Corredig： 撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、验证、监督、资源协调、项目管理、方法论、资金获取、正式分析、数据管理、概念构思。Jan Skov Pedersen： 撰写 – 审稿与编辑、验证、软件、资源协调、方法论、资金获取、正式分析。Bine Simonsen： 撰写 – 审稿与编辑、正式分析。Gokhan

未引用的参考文献

Zhang等人，2025。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

该作者是本期刊的编委会成员/主编/副主编/客座编辑，未参与本文的编辑审查或出版决定。

致谢

SR-CD测量是在位于丹麦奥胡斯大学物理与天文学系的ASTRID2同步辐射源的AU-CD光束线上进行的（ISA）。本研究得到了Villum Fonden（37759），通过Villum研究员奖（由Novo Nordisk基金会资助），以及丹麦高等教育与科学局（ESS Lighthouse：食品和制药中的胶体与界面项目；授权号726510）的资助。

G?khan U?ur At?l|Antara Pal|Nykola C. Jones|S?ren V. Hoffmann|Bine Wissendorf Simonsen|Jan Skov Pedersen|Milena Corredig

奥胡斯大学食品科学系，Agro Food Park 48，8200，奥胡斯N，丹麦